快速、同时分离九种脂溶性维生素的单次进样超...（二）

实验

样品描述

七种脂溶性维生素：视黄醇乙酸盐(维生素A乙酸盐)、视黄醇棕榈酸盐(维生素A棕榈酸盐)、α-生育酚(维生素E)、α-生育酚乙酸盐(维生素E乙酸盐)、麦角骨化醇(维生素D2)、维生素K1、维生素K2 (MK-4)；及两种胡萝卜素：番茄红素及β-胡萝卜素均购自西格玛公司(Sigma Aldrich)，并且未经处理直接使用。将所有样品以约0.1 mg/mL的溶解到甲基第三丁基醚(MTBE)中，并转移到进样瓶中，准备进行分析。

UPC²条件

系统：  配备PDA检测器的ACQUITY UPC²

流速：  1 mL/min

流动相A：CO₂ 

流动相B：乙腈 

色谱柱： ACQUITY UPLC HSS C₁₈ 3.0 x 100 mm，1.8 µm                                              

背压：   2500 psi 

柱度：   30 °C 

样品稀释剂：MTBE 

进样量：    1µL

样品瓶：    沃特世玻璃瓶12 x 32 mm螺纹颈瓶，2 mL
PDA扫描范围：210 - 600 nm 

数据管理：   Empower 3软件 

梯度：

结果与讨论
已有大量文献阐述了利用NPLC及RPLC分离脂溶性维生素以及类胡萝卜素的方法。^1,3-5由于在分析脂溶性维生素时，通常需要使用低极性有机溶剂来溶解样本，因此NPLC由于其与有机溶剂的相容性而具有一定优势，可允许直接进样脂溶性维生素或脂溶性维生素萃取物，而不需要进行蒸发步骤。RPLC法的色谱分离效率虽然高于NPLC，⁷但由于以下几点原因，阻碍了其在进行FSV分析上的应用：1)分析物在流动相中溶解度较低，2)对FSV的保留力强，导致运行时间过长。最终，人们选择使用半水性流动相(甲醇或乙腈与水的混合物)或非水性流动相；后者也称为非水性反相(NARP) LC。^7-8 UPC²，虽然常作为正相分离技术，但也同样适用于分离极性较低的分析物。UPC²的主流动相CO2不仅是低极性分析物的良好溶剂(与己烷的极性相近)，也可与在样品分离过程中用于溶解这些分析物的有机溶剂(例如本研究中所使用的MTBE)相同。此外，CO₂的低极性也可促进分析物与流动相之间的非极性相互作用，从而缩短保留时间和运行时间。

在进行方法开发时，共选用了六种色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3、ACQUITY UPLC HSS C₁₈、ACQUITY UPC² HSS SB、ACQUITY UPC² CSH氟苯基、ACQUITY UPC² 2-乙基吡啶、及ACQUITY UPC² BEH，

以及四种溶剂，包括：异丙醇(IPA)、乙腈(ACN)、乙醇、及IPA/ACN的1：1混合液。只有使用ACQUITY UPLC HSS C₁₈色谱柱以及ACN的方法才可将非常相似的维生素K1以及K2分离。采用较低的柱温，30 °C，原因如下：首先，为了提高K1与K2的选择性；其次，为了最大限度地减少胡萝卜素在色谱柱上的降解，因为胡萝卜素非常容易氧化。

经方法优化后所得的每种成分的色谱图以及UV谱分别如图2及3所示。大体上，九种脂溶性维生素的洗脱顺序与它们的LogP值排序相同。利用低乙腈含量(2%)的流动相就可将七种维生素全部洗脱出来，而两种胡萝卜素则需要使用含20%乙腈的流动相才可洗脱出来。这一现象，可由分析物的结构以及它们与流动相/固定相之间的相互作用来解释。在九种分析物中，均存在CO₂与脂溶性维生素亲脂性基团之间的非极性相互作用，而七种维生素中的氧原子(呈羰基或羧基的形式)使得分析物与流动相中的乙腈之间产生极性相互作用，这样就减少了溶离时间。而两种胡萝卜素分子不含有杂原子，且分子中的非极性十八烷基碳链更容易与固定相形成较强的相互作用，因而其溶离时间更长。