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鼠肝细胞器的超速分离方法举例

2020.7.14

Ⅰ.前处理:
鼠肝匀浆,台式离心机1,000xg,10分,取上清,沉淀稀释后再1,000xg,10分,取上清,再重复一次取上清,三次上清液合并用于超速离心。

Ⅱ. 密度梯度离心:
日立超速离心机(各种型号)
转头:P45AT(6×94ml,实际容量85ml)
不连续蔗糖梯度:10%,20%,30%,40%,50%(w/w),各15ml,样品约10ml铺在表面
转速:40,000rpm,186,000xg
时间:2.5hr
温度:4℃
加速/减速:6/6

Ⅲ. 结果:
用日立DGF-U或手工取出梯度液,自上而下收集成30管,每管分别测定密度及测定260nm ABS值并绘成如下曲线:

可以看出:水溶性蛋白沉降在近离心管表面的及低蔗糖密度区;核糖和蛋白体沉降在16%-18%蔗糖密度区;光滑质膜沉降在27%-28%蔗糖密度区;质膜沉降在37%-38%蔗糖密度区;线粒体沉降在42%-43%蔗糖密度区,而粗质膜沉降在45%-46%蔗糖密度区。


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