胰岛素受体对胰岛素亲和性的测定实验

试剂、试剂盒 牛血淸白蛋白猪胰岛素[125I]胰岛素（受体级）结合缓冲液

实验步骤

材料

[125I]胰岛素（受体级）（DuPontNENNEX196)

猪胰岛素（如，Sigma Chemical Co,I3505)

牛血淸白蛋白（BSA;1%)

试剂

结合缓冲液（冷配体置换实验用)

(配方，见“试剂的配制”，PP.234~240)

操作程序

1)于微量离心管中建立下列反应体系：

2)各离心管置摇床上，室温下孵育2h。

3)各管用微型离心机离心20min,去上清。

4)用γ-计数器计数离心管内的放射性强度。分别从第1至6管的cpm值中减去第7管的cpm值（非特异性cpm值和本底cpm值)，得特异结合的cpm值。

5)将各管的特异性结合cpm值除以总cpm值，得与膜结合的那部分胰岛素所占的份额。该值乘以各管中的胰岛素浓度，即得配体-受体复合物的浓度（[HR]，亦称[B],它表示结合的配体)。

6)从管中的胰岛素浓度减去[HR],得游离配体的浓度（[H],亦称[F],它表示游离的配体)。

7)至此，可用几种方法分析所得的结果。如能用计算机程序，将数据直接代入下式则更好：

也可通过[HR]对log([H])作图来分析这些数据。此图应给出S型曲线。于是，可分别从[HR]的最大值和曲线的拐点得出受体总数和KD值（Klotz,1982)。第三种方法是用斯卡査德（Scatchard)图分析数据，斯卡査德图就是所作的图。若只有一种类型的结合位点,则斯卡査德图为一直线。为作斯卡査德图，先要确定对应于每个[H]的[HR]/[H]值，然后以[HR]/[H]值对[HR]作图,此线的斜率为-1/KD，横坐标的截距力受体总数([R]t)。若有多于一种类型的结合位点,且有不同的亲和性时，斯卡査德图将是一条曲线而不是直线。