(1)蛋白质样品的制备 :有两种方法(直接加样缓冲液来裂解细胞,制备细胞蛋白质提取液)。

(2)十二烷基酸钠-聚丙烯电泳(SDS-PAGE分离原理:根据蛋白质的分子差异)

电泳:在直流电场作用下,带电的粒子向着与自身电荷相反的方向移动的现象。电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。

(3)蛋白质的电转移 采用的固相支持物有很多种,常用的有硝酸纤维素膜和聚偏氟乙烯。

可以根据需要转移蛋白质的分子量大小,选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为可以随着膜孔径的不断减小,这样膜对低分子量蛋白质的结合就更加牢固。

蛋白质是带负电荷的,所以应该置于凝胶的负极侧,硝酸纤维素膜置于正极一侧,这样接通电源后,凝胶中的蛋白质就可以由负极向正极转移到硝酸纤维素膜上,完成蛋白质的转移工作。         重要影响因素:转膜缓冲液的组成对于蛋白质与膜和探针的结合起着非常重要的作用。

(4)靶蛋白的免疫学检测:

1.封闭:在硝酸纤维素膜和蛋白质结合之外,还可以为检测试剂的特异性的第抗体发生非特异性结合。这样使Western印迹的背景提高,所以需要对硝酸纤维素膜上面的潜在结合位点进行封闭操作。

封闭剂:凝集素,血白蛋白,牛血清白蛋白,酪蛋白,脱脂奶粉等根据要求合理的选择用哪一种。

2.靶蛋白与第抗体反应:抗体是蛋白质印迹技术中最常用的标记探针同时也是免疫印迹实验成败的关键因素之一。

3.靶蛋白与第二抗体反应:这里的第二抗体是针对第一抗体的免疫球蛋白,是可以用放射性核素或者非放射性物质标记。

目前常用的二抗:碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶。

4.显色:AKP(碱性磷酸酶)可以和催化底物BCIP(四硝基蓝)与氮蓝四锉(NBT)发生反应,产生深蓝色,就是蛋白质所在的位置。

另一种是检测辣根过氧化物酶:辣根过氧化物酶在过氧化氢的存在下,可以氧化鲁米诺使其法光,并使其的光强度增加1000倍,在经过X线胶片可以显示蛋白质所在的位置和含量。