关于黄曲霉毒素M1的高效液相色谱法检测分析步骤介绍

　　（1）AFM1标准溶液的配制

　　先用乙腈配制2000μg/mL的AFM1标准溶液，再用苯-乙腈（9:1）溶液配制成0.5μg/mL的AFM1标准浓度工作液，可用紫外分光光度计校正浓度（AFM1在乙腈中的摩尔消光系数为19850）。

　　（2）色谱条件

　　色谱柱：含球形的5μm颗粒大小的C18键合硅胶柱，柱长 25cm，内径0.4mm（如Spherisorb 5 ODS2）

　　检测器：具有365nm激发波长，>400nm的发射波长，对lng AFM1-TFA衍生物的灵敏度为50～100%满刻度响应的荧光检测器（如Spectroflow 980）

　　流动相：水：异丙醇：乙腈（80:12:8）

　　流速：1.0mL/min

　　进样量：50～100μL

　　（3）样品提取、纯化

　　用C18 Sep-Pak试样提取柱或0.8×4.0cm的硅胶60净化柱净化乳液样品，乳液样品需充分混匀使不均质的乳脂分布均匀，加入同体积的热水（约80℃）充分稀释乳液。净化柱相继用乙醚；水-乙腈清洗，上样后用CH2Cl2-乙醇进行AFM1的洗脱上样和洗脱时流速不易过快，否则会得到偏低的回收率，然后将含AFM1的洗脱液真空低温（<35℃）浓缩或氮气流下室温吹干，用CH2Cl2转移残留物至小瓶中，氮气流下蒸气浴挥干，备用。

　　（3）衍生物的制备

　　将200μL己烷及200μL三氟乙酸（TFA）加入含有样品残留物的小瓶中，涡流混合器上振摇5～10sec，40℃水浴中加热10min，通氮气加热挥发至干，制成的衍生物加入2mL水-乙腈（75:25）充分振荡，供液相色谱分析。

　　标准AFM1的衍生物制备：加200μL己烷及50mL三氟乙酸（TFA）于小瓶混合，加入50μL AFM1标准工作溶液，振摇5～10sec，如前所述样品的衍生物同样处理。

　　（4）检测

　　用峰高或峰面积作标准曲线，结果应保证线性关系，AFM1的保留时间为4～5min。根据峰高或峰面积、标准溶液浓度、进样体积、样品的总体积来计算出样品中AFM1的浓度。该方法的灵敏度为0.01～0.5μg/L，回收率在80%～100%之间。