大鼠血清、血浆及相关液体样本中抵抗素的含量检测
实验概要
本实验采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。将标准品、待测样本加入到预先包被大鼠抵抗素(resistin)单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中大鼠抵抗素(resistin)浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中大鼠抵抗素(resistin)含量。
主要试剂
大鼠抵抗素(resistin)定量检测试剂盒(ELISA) [上海锐谷生物科技有限公司]
蒸馏水
主要设备
1. 37℃恒温箱
2. 标准规格酶标仪
3. 精密移液器及一次性吸头
4. 一次性试管
5. 吸水纸
实验步骤
1. 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
2. 配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3. 加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加。
4. 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5. 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
6. 加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。
7. 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
8. 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
9. 显色：每孔先加入显色剂A 液50μL，再加入显色剂B液 50μL，平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s)，37℃避光显色15min。
10. 终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。
11. 测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。
12. 计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
注意事项
1. 实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。
2. 酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。
3. 建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测，取平均值，以减小实验误差。
4. 牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。
5. 本试剂盒定量范围为2.5-80μg/L，超过此范围，为标准曲线延伸计算所得，不做为准确定量结果，请用特殊稀释液稀释后测定准确结果(2.5-80μg/L范围内)，乘以总稀释倍数即为样本最终浓度。
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