流式细胞仪构成与工作原理
流式细胞仪构成与工作原理 张 艺 (南京师范大学生命科学院 ,江苏 南京 210046) [摘 要]流式细胞仪是分选细胞结构与功能 ,准确迅速选标记细胞的仪器。本文讲述流式细胞仪的主要组件,工作原理及其实 际应用。 [关键词]流式细胞仪 ;流式细胞术 [中图分类号] T H776 [文献标识码]B [文章编号]1007 - 7510 (2005) 08 - 0025 - 02 The introduction to the f lo w c ytometer ZHAN G Yi (College of L ife Scie nces of N a njing No r mal U niversit y ,N a njing J ia ngsu 210046 ,China) Abstract :Nowadays t he flow cyto meter is a usef ul app arat us in ho spit als a nd labo rato ries. Well k now n fo r it s accuratel y a nd quickly picking up t he mar ked cells ,it is of te n used to a nal yze t he co nte nt s a nd f unctio ns of t he cell. In t his p aper , I int ro duce it s co nstit ue nt part s ,operating p rinciples a nd act ual applicatio ns. Key words :flow cyto meter ;flow cyto met y 流式细胞仪 (flow cyto meter) 是采用流式细胞术的典型 仪器 ,它能迅速的对单个细胞及其群体的化学物质的含量与种 类作出分析 ,对含指定化学物质的细胞进行分选。 1 流式细胞仪的主要组件 流式细胞仪一般由液流系统、激发光器件、信号检测系统 和控制系统四大基本组件构成。具有细胞分选功能的流式细胞 仪还有分选系统(见图 1) 。 2 流式细胞仪的工作原理 流式细胞术 ( FCM) , 顾名思义就是细胞在流动状态下的 检测技术。流动的悬浮在液体中的分散细胞一个个地依次通过 测量区 , 该测量区是激光与液流交汇之处 , 带有特异性荧光标 记抗体的细胞当暴露于 488nm 蓝绿激光束时 , 染色的细胞发 出荧光 ,荧光染料受到激光激发 ,释放一定波长的光 ,这些信号 转化为电信号 , 再进一步被测量、存储、显示 , 细胞的一系列重 要的物理特性和生化特征 , 如大小、内部结构、DN A 、RN A 蛋 白质、抗原等就被快速地 ,大量地测定。 2. 1 液流系统 主要是由鞘液、细胞悬液和流动室组成。在气 体压力的作用下 , 流动室内充满的鞘液从喷嘴喷出形成鞘液 流 , 细胞悬液在鞘液流的吸引下和气体压力的作用下经导管输 入流动室 , 正对流动室的喷嘴喷射。细胞悬液内的细胞在鞘液 流的约束下排列成单列 , 由流动室的喷嘴喷出 , 成为细胞液 柱。 激光器件产生光束 , 与细胞液柱垂直相交 , 相交点即为测 量区。激光器是使用最多的发光器件 , 也有用汞灯和氙灯作为 流式细胞仪的激发光源。 信号检测系统由特异信号检测器件和非特异信号检测器 件构成。当细胞液柱内的细胞经过测量区时 , 在激发光的照射 下 , 产生特异的荧光信号和非特异的前向角散射与侧向角散射 信号 , 荧光信号由 PM T 检测 , 前向角散射由光电二极管检 测。因此 , 流式细胞仪可同时检测同一个细胞的至少三种参 数。荧光信号的种类与产生荧光的化学物质以及与特异荧光色 素结合的化学物质有关 , 90o 侧散射光的大小与细胞内部的颗 粒有关 ,前向角散射光的强度与细胞的大小有关 ,尽管如此 ,流 式细胞仪对细胞形态的分辨率为零。现在已有同时使用三个不 同的波长的激光器 , 同时检测同一细胞的九种荧光信号和两种 非特异的前向角散射与侧向散射信号共 11 个参数的流式细胞 仪 , 这对丰富人们对细胞化学物质间的相互关系的认识具有极 [收稿日期] 2005 - 03 - 09 大的作用。 图 1 流式细胞仪结构模式图 仪器原理与使用 ·26 · 医疗设备信息 20 卷 8 期 ≠ 2005. 8 细胞分选系统首先使流动室上方的超声振荡器产生机械 振动 , 导致流动室随之振动 , 于是细胞液柱断裂成一连串均匀 的液滴 , 当包有细胞的液滴经过测量区时 , 信号的检测系统对 其特异信号进行检测 , 如果其特性与要分选的细胞特性相符 , 则控制系统给这个细胞液滴充以指定的电荷 , 当这个带有电荷 的细胞液滴向下落入偏转板的高压静电场时 , 依所带电荷落入 指定的收集器内 ,完成对细胞的分类收集。 控制系统是流式细胞仪控制中枢 , 负责对整个仪器的调 试、设置、控制和测量参数的分析。 3 流式细胞仪的应用 3. 1 科研应用 主要用于细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细 胞术与分子生物学研究。 3. 2 临床应用 3. 2. 1 在肿瘤学中的应用 这是 FCM 在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要 把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液 ,用荧光染料 (碘化 吡啶 P I) 染色后对细胞的 DN A 含量进行分析 , 将不易区分的 群体细胞分成三个亚群( G1 期 , S 期和 G2 期细胞亚群) ,DN A 含量直接代表细胞的倍体状态 , 非倍体细胞与肿瘤恶性程度有 关。 (1) 发现癌前病变 ,协助肿瘤早期诊断。FCM 可精确定量 显示 DN A 含量的改变 , 作为诊断癌前病变发展至癌变中的一 个有价值的标志 , 能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价 , 有助于癌变的早期诊断。 (2) 在肿瘤的诊断、愈后判断和治疗中的作用: FCM 在肿 瘤诊断中的重要作用已经被认可 , DN A 非整倍体细胞峰的存 在可为肿瘤诊断提供有利的依据 , FCM 分析病变细胞具有速 度快、信息量大 :敏感度高等优点 ,已被用在常规工作中。肿瘤 细胞倍体分析对病人愈后判断有重要作用 , 异倍体肿瘤恶性病 变的复发率高、转移率高、死亡率也高 ,而二倍体及近二倍体肿 瘤的愈后情况则较好。 FCM 不仅可以对恶性肿瘤含量进行分析 , 还可根据化疗 过程中肿瘤 DN A 分布直方图的变化去评估疗效 , 了解细胞动 力学变化 , 对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细 胞周期各时相的分布情况 , 依据化疗药物对细胞动力学的干扰 理论 , 设计最佳的治疗方案 , 从 DN A 直方图直接地看到肿瘤 细胞的杀伤变化 , 及时选用有效的药物 , 以对肿瘤细胞达到最 大的杀伤效果。 此外 , FCM 近几年还被应用于细胞凋亡和多药耐药基因 的研究中。FCM 对多药耐药基因( P170 等) 凋亡抑制基因及凋 亡活化基因表达测定 ,可为临床治疗效果分析提供有利依据。 3. 2. 2 在血液学中的应用 (1) 检测白血病和淋巴瘤细胞; (2) 检测活化血小板: 血小 板的活化是血栓形成的重要环节 , 检测血小板的活化状态可以 辅助诊断和监控血栓性疾病 , 对判断血栓前状态的意义也非常 重大 ; (3) 造血干细胞 (CD34 + ) 计数 ; (4) 白血病免疫分型 : CM P0/ CCD79a/ CCD3 (三系筛选) , CD5/ CD7/ CD3 ( T 系) , CD20/ CD10/ CD19 (B 系) , CD33/ CD34/ CD45 (髓系) 等 ; (5) 网织红细胞计数; (6) 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测。 3. 2. 3 在免疫学中的应用 FCM 通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析 , 进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的 评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。流式细 胞仪可以进行淋巴细胞及其亚群分析; 淋巴细胞免疫分型; 检 测细胞因子 , 如 IL 2 - 受体 (CD25) 、IL - 12 受体、E GF - 受 体 , TN F - 受体 , T GFβ- 受体、胰岛素受体。 4 注意与补充 流式细胞仪并非是完全自动化仪器 , 其检测效果还需要准 确的人工技术配合 , 所以只有在严格的质量控制下获得定量检 测数据才有意义。 目前 , 流式细胞仪是分选特异标志细胞群的主要手段之 一 ,但是受到了免疫微球分选细胞方法的挑战。 [参考文献] [ 1 ] 蔡文琴 . 现代实用细胞与分子生物学试验技术[ M ]. 北 京 :人民军医出版社 ,2003. ☆ 2. 2 打开腔室门 , 使机器进入维修模式 (方法与压力校准一 样) ,选择温度校准功能 ,两次按压 SAV E V AL U R E 触摸键 , 这时屏幕显示 “C HA MB ER D RA IN T EM P ERA TU R E CAL IB RA T IO N”, 往腔内排气口倒入一升温度与室温相同 的自来水 , 等待五分钟稳定 , 观察屏幕显示的温度和温度表显 示情况 ,调节电路板上电位器 R4(ZERO) ,直到显示的温度和 温度表的数值一致 ,完成温度的下限校准。 2. 3 关闭腔室门 , 按压 CO N T IN U E 键 , 机器自动打开进蒸 汽阀 , 内腔进蒸汽 , 一分钟后 , 进气阀关闭 , 等待五分钟让内腔 充分加热并且压力趋于稳定 , 观察屏幕显示的温度和温度表显 示情况 , 调节电路板上电位器 R10 (SPAN) , 直到内腔显示的 温度与温度表的数值一致。完成温度上限校准。如果调整 R4 和 R10 的结果相互间有影响 , 则重复第二步到第三步 , 直到准 确。 2. 4 按压 CO N T IN U E 键 , 机器快速排气到 0. 0p si , 温度校 准完成。总结 只要我们医学工程人员平时对设备多了解、多探 索 , 很多故障是不用更换零配件就能排除的 , 正确的维护、保 养 ,能确保设备的正常运转 ,既能及时排除故障 ,又为医院节约 不必要的开支。
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