引物设计原则（Principle of real-time quantiation PCR primer ）
1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74°C，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3、引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4、引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72°C左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最临近法（the nearest neighbor method)。
6、△G值是指DNA链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7、引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5Kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8、对应物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR引物的载体的相应序列而确定。
引物序列应该都写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 产物长度一般在15～30碱基之间
④ G+C含量在40%～60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5’端可以修饰
⑨ 引物3’端不可修饰。
⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。
1、 引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2、 避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkj/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
