柱离心法纯化质粒DNA实验
实验原理
1. 离心柱结构：特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。
在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。
2. 碱变性抽提的原理是在pH高于12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，破坏了碱基配对，导致双螺旋结构解开而变性，但闭环的质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH调至中性时，质粒DNA链迅速恢复到原来构型，仍保存于溶液中。而变性的染色体DNA不能再复性，通过离心，随不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，使两者得以分离。
实验试剂
1. 试剂盒自带溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
2. 漂洗液
3. 结合缓冲液
4. 洗脱缓冲液
5. TE buffer
实验设备
1. 吸附柱
2. 取液枪
3. 离心机
4. 低压电泳仪
5. 水平电泳槽
6. 紫外透射仪
实验材料
带有质粒的大肠杆菌
实验步骤
1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时；
2. 取液体培养液3ml(1.5mlX2)于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100ml 溶液I，充分混匀；置冰上；
3. 加入150ml 溶液II，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置1-2min；
4. 加入150 m l 溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min；
5. 用台式高速离心机，12000r/min离心10min；
6. 吸附柱中加入420ul 结合缓冲液，将步骤5中的上清转移至吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀， 12000r/min离心1min；
7. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul 漂洗液 , 静置1 min，12000r/min离心30 s；
8. 重复步骤7一次；
9. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，12000r/min离心2min；
10. 吸附柱放入一个新的1.5ML离心管，在吸附柱的中央加40ul洗脱缓冲液或 TE buffer,室温放置3-5分钟。盖好盖子12000rpm 离心1分钟，收集质粒DNA溶液。
11. 取5ul 电泳检查，(100ml凝胶加入5ul 染料)。
注意事项
加样时要排出枪头中的空气，以免搅动液面。
