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Agilent SureSelectQXT WGS 文库制备的质量控制

2020.8.11

　　本应用简报按照 Agilent SureSelectQXT WGS 文库制备方案，介绍了 Agilent 4200 TapeStation 系统在工作流程中的样品质量控制 (QC) 性能。基因组 DNA ScreenTape 分析法是对基因组 DNA 起始材料进行系列定量分析并提供完整性信息的可靠方法。安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法可在测序前对扩增的标签文库进行分子量测定和定量分析。数据还表明，采用 DNA ScreenTape 分析法所获得的结果与使用 Agilent 2100 生物分析仪系统和 Qubit 荧光计进行分析所得到的信息相一致。

　　前言

　　Agilent SureSelectQXT 全基因组文库制备试剂盒可生成用于 Illumina 配对末端多重测序的文库。SureSelectQXT 文库制备对基因组 DNA (gDNA) 的起始量变化非常敏感。本方案建议使用 Qubit 仪器进行两次系列荧光分析来定量。采用基因组 DNA ScreenTape 分析法在 Agilent 4200 TapeStation 系统上运行相同样品，比较这两种方法所获得的结果。gDNA 起始量的偏差会导致所得片段分布不理想，使扩增文库中过大或过小的 DNA 片段所占比例过高。这种效应可以通过由各种 gDNA 起始材料（从低丰度到高丰度）产生的额外文库来说明。

　　扩增文库使用安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法及 4200 TapeStation 系统进行分析，将其结果与 SureSelectQXT 方案推荐的高灵敏度 DNA 分析法及 Agilent 2100 生物分析仪系统分析所得结果进行比较。

　　扩增文库的分析结果显示，高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析与 2100 生物分析仪系统获得的分子量和摩尔浓度结果相一致。

　　材料与方法

　　4200 TapeStation 系统 (G2991AA)、2100 生物分析仪系统 (G2939AA)、SureCycler 8800 热循环仪 (G8800A)、用于 WGS 的 SureSelectQXT 文库制备试剂盒 (G9682A)、高灵敏度 D5000 ScreenTape (5067-5592) 和试剂 (5067-5593)、基因组 DNA ScreenTape (5067-5365) 和试剂 (5067-5366)、高灵敏度 DNA 试剂盒 (5067-4626)，以及 OneSeq 参比 DNA 男性 (5190-8848) 购自安捷伦科技公司。NanoDrop 1000、Qubit 3.0 荧光计 (Q33216) 和Qubit dsDNA BR 分析试剂盒 (Q32850) 购自赛默飞世尔科技公司。使用区域功能来实现 DNA 文库的定量测定。除非另有说明，否则所有分析均按照生产商的方案和指南进行。

　　结果与讨论

　　图 1 说明了使用 gDNA 作为起始材料生成全基因组测序 (WGS) 文库的 SureSelectQXT 方案。简而言之，样品在一步酶解步骤中进行碎裂和接头标记，然后进行 PCR 扩增，在此期间对接头连接的片段进行扩增和标记。然后使用磁珠清洁扩增的接头连接的文库，并在测序前分析以确定合适的分子量、数量，并进行纯度（不含接头二聚体产物）评估。

　　gDNA 的数量和完整性

　　SureSelectQXT WGS 方案需要高质量的 DNA 样品，以获得最佳性能和 gDNA 起始材料的精确定量结果。按照该方案使用配有 dsDNA BR 分析试剂盒的 Qubit 仪器进行系列定量分析。将相同的样品在 4200 TapeStation 系统和 NanoDrop 中均进行6次重复基因组 DNA ScreenTape 分析。图2显示了获自 4200 TapeStation 系统、Qubit 和 NanoDrop 的数据，说明了基因组 DNA ScreenTape 分析法适用于对 gDNA 起始材料进行定量分析。采用UV 光谱法测定 gDNA 所得的量常会过高，这是由于其他缓冲液成分在 UV 光谱中也可能有吸收[4]。

　　此外，基因组 DNA ScreenTape 分析法可在同一 QC 步骤中客观评价样品完整性。样品完整性由 TapeStation 分析软件的 DNA 完整值 (DIN) 计算功能自动测定（图 3）。

　　与其他系统不同的是，基因组 DNA ScreenTape 分析方法及 4200 TapeStation 系统只需 1 µL 样品即可在一步分析中同时对质量和数量进行评价。

　　Agilent SureSelectQXT 全基因组文库的片段分子量测定

　　除了 gDNA 起始材料的初始质量控制外，SureSelectQXT 方案还建议对扩增文库进行质量控制，从而确保在测序前显示整个片段的分子量范围。片段平均分子量显著小于 600 bp 可能表明碎裂反应中的 gDNA 过少，或者可能与测序数据的重复分析次数增加有关。相反，文库中片段平均分子量过大（超过 1000 bp）可能表明碎裂反应中的 gDNA 过多，并且可能需要更高的 DNA 浓度以在测序反应中获得最佳的群集密度。

　　为了证明这一点，制备起始量为 20、50 和 80 ng 的文库，用 50 ng gDNA 样品生成的文库作为标准文库。图 4显示了与 2100 生物分析仪系统相比，4200 TapeStation 系统在评估分子量测定方面的性能，通过用上述起始量对文库进行三次重复区域分析来评估。图中的数据展现了两个系统所得的文库分子量有很好的相关性。

　　不同 gDNA 起始量的电泳叠加图显示，使用 2100 生物分析仪 (A) 和 4200 TapeStation (B) 系统，文库片段分子量分布（图 5）呈现出不同的弥散条带曲线。50 ng 的最佳 gDNA 起始量可得到平均分子量在 600–1000 bp 之间的文库曲线。最小的 gDNA 起始量产生的文库通常会导致其分子量范围趋向于更小。相反，gDNA 起始量过大会导致大 DNA 片段比例过高，从而产生的文库的分子量范围趋向于更大。此外，所有电泳图均未显示接头二聚体产物，表明文库纯度很高。

　　SureSelectQXT 全基因组文库的定量分析

　　对于多重测序，将 SureSelectQXT 全基因组文库合并，使每个插入标记的样品在库中的摩尔量相同。文库的最佳起始浓度取决于测序平台。它可能还需要根据文库的 DNA 片段分子量范围进行优化，以获得所需的最终量和数据质量。4200 TapeStation 和 2100 生物分析仪系统可在区域表中提供摩尔浓度定量数据和分子量信息（图 6）。

　　对于每个由不同 gDNA 起始量产生的文库，将其摩尔浓度绘制在两个系统的对比图中（图 7）。

　　表 1 中的汇总数据表明，使用高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法得到的扩增文库的分子量和定量分析结果，与 SureSelectQXT WGS 方案推荐的 2100 生物分析仪系统及高灵敏度 DNA 分析法得到的结果相一致。

　　结论

　　本应用简报证明了 Agilent 4200 TapeStation 是可用于 Agilent SureSelectQXT WGS 文库制备过程中进行样品分析的可靠系统。

　　高质量 DNA 样品和 gDNA 起始材料高重现性的定量结果是成功制备 SureSelectQXT 文库必不可少的条件。安捷伦基因组 DNA ScreenTape 分析法可对基因组 DNA 起始材料实现精确定量分析，并在同一 QC 步骤中对样品完整性进行评估。

　　安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法是用于 SureSelectQXT WGS 扩增文库的分子量测定和定量分析的理想工具。4200 TapeStation 系统除了具有与 SureSelectQXT 方案推荐的Agilent 2100 生物分析仪系统等效的性能外，还具有高度灵活的样品通量和易用性。

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周锦帆