聚丙烯酰胺凝胶电泳原理特性和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电...-2
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel
electrophoresis，简称PAGE）根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统2大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰及分辨率均较前者佳。目前常用的多为垂直的圆盘及板状两种。前者凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状，因而称为圆盘电泳（disc
electrophoresis），其装置如图3-4；后者，凝胶是在2块间隔几毫米的平行玻璃板中聚合，故称为板状电泳（slab
electrophoresis）。两者电泳原理完全相同。现以R.J.Davis等（1964）用高pH不连续圆盘PAGE分离血清蛋白为例，阐明各种效应的原理。
不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶所组成，它们在直立的玻璃管中（或2层玻璃板中）排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶，如示意图3-5。
样品胶是聚合成为的大孔胶，T=3%，C=2%，其中含有一定量的样品及pH6.7的Tris-HCl凝胶缓冲液，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲液稀释。目前，一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%蔗糖，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。
实际上，浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及pH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，从而提高分离效果。
分离胶是聚合成的小孔胶，T=7.0~7.5%，C=2.5%，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl，大部分血清中各种蛋白质在此pH条件下，按各自负电荷量及分子量泳动。此胶主要起分子筛作用。
上、下电泳槽是用聚苯乙烯或二甲基丙烯酸制作的。将带有3层凝胶的玻璃管垂直放在电泳槽中，在两个电极槽倒入足够量pH8.3
Tris-甘氨酸电极缓冲液，接通电源即可进行电泳。在此电泳体系中，有2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值，因而形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。PAGE具有较高的分辨率，就是因为在电泳体系中集样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应为一体。下面就这三种物理效应的原理，分别加以说明。
1．样品浓缩效应
（1）凝胶孔径不连续性：上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶T=3%为大孔胶；分离胶T=7%或7.5%为小孔胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在2层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
（2）缓冲液离子成分的不连续性：电泳液中含甘氨酸离子，pH为8.3；样品层及浓缩胶层中含氯离子，pH6.7；分离胶层中亦含氯离子，pH为8.9时，甘氨酸的解离度（a）较小，其有效迁移率（即迁移率×解离度）亦较小，故甘氨酸常被称作慢离子（或随后离子、结尾离子）。盐酸是全部离解的，其有效迁移率最大，常被称作快离子（或先导离子、先行离子等）。而在pH6.7时，蛋白质的有效迁移率介乎于上面两者之间。
电泳开始后凝胶中氯离子、甘氨酸负离子、样品蛋白质离子都向正极移动，而且它们的有效迁移率（迁移率乘以离解度为有效迁移率）按以下次序排列：氯离子＞蛋白质阴离子＞甘氨酸阴离子浓缩胶中氯离子（称快离子），很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。因为，电位梯度（E）与电导率成反比，所以低电导区有较高的电位梯度，这就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子（称慢离子）在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐地被压缩，聚集成一条狭窄的起始区带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。不连续电泳浓缩效应如图3-6所示。
