毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册（2）
一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制
1．1 各种母液的配制
10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。
500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。
100*H （0.4%Histidine 组氨酸） 4℃保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。
10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。
10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。
10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸） 4℃保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
1.2 常用溶液及缓冲夜
1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：
溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)
溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％ SDS（临用时配制）
溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O 至100 ml。
4℃保存。
1.2.2 10% 甘油 （Glycerol）：
将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为1年以上。
1.2.3 Rnase-H2O：
1ul Rnase 加入1ml 灭菌 dd H2O。4℃保存。
1.2.4 TE缓冲液：
10mmol / Tris-CI（pH 8．0）， lmmol / L EDTA（pH 8.0）
1.2.5 STE缓冲液：
0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)
1.2.6 SCE缓冲液：
1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠 ， 10mmol / L EDTA
1.2.7 1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：
132 ml 1M K2HPO4
868 ml 1M KH2PO4
1.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：
242 g Tris
57.1 ml Acetic Acid
37.2 g EDTA
二．毕赤酵母表达的培养基配制［5］
2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：
Trypton l％
Yeast Extract 0.5％
NaCl l％
PH 7.0
制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：
Trypton l％
Yeast Extract 0.5％
NaCl 0.5％
PH 7.0
制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD （又称YEPD）
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）
Trypton 2%
dextrose (glucose) 2%
+agar 2%
+Zeocin 100 μg/ml
