[实验目的]

　　通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术

　　[实验原理]

　　细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

　　[实验仪器与设备]

　　1．超净工作台 2.低温离心机

　　3. 恒温摇床 4. 恒温箱

　　5. -70℃ 6. 恒温水浴器

　　[实验材料]

　　1.氯化钙(CaCl2) 2.胰蛋白胨

　　3.酵母提取物 4.氯化钠(NaCl)

　　5.氨苄青霉素 6.大肠杆菌DH5α

　　7.pUC19质粒 8. 50ml离心管

　　9.吸头、培养皿、锥形瓶等

　　附试剂的配制：

　　1. 0.1mol/L CaCl2溶液

　　2. LB液体培养基

　　配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：

　　胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g

　　酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g

　　NaCl 10g

　　摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。

　　3．氨苄青霉素（Amp）,用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。

　　[实验步骤]

　　1．从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

　　2．取0.5 ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中, 37℃振荡培养2-3h.(此时,OD600<=0.5,细胞数务必<108/ ml,此为实验成功的关键).

　　3.将菌液转移到50 ml离心管中,冰上放置10min.

　　4.离心10min(4000rpm),回收细胞.

　　5.倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽.

　　6.用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。

　　7．0-4℃6000rpm，离心10min，回收细胞。

　　8．用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml悬浮细胞 。（务心放冰上）

　　9．分装细胞，每200μl一份。此细胞为感受态细胞。

　　10．取200μl新鲜配制的感受态细胞，加入DNA 2μl（50ng）混匀，冰上放置30min。

　　同时做两个对照管：

　　受体菌对照：200μl感受态细胞+2μl无菌水

　　质粒对照：200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl质粒DNA溶液

　　11．将管放到42℃循环水浴1-2min。

　　12．冰浴2min.

　　13．每管加800μl LB液体培养基，37℃培养1h(慢摇)。

　　14．将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的固体培养基上。

　　15．倒置平皿37℃培养12-16h，出现菌落。