五、蛋白质的盐析法
向蛋白质溶液中加入不同浓度的中性盐，可以把不同的蛋白质分别沉淀出来。这种方法称为蛋白质的盐析。
利用蛋白质的盐析法，可以得到我们所需的不同的免疫球蛋白。最常用的中性盐包括，硅酸铵、硫酸镁、硫酸钠等，其中以硫酸铵最为常用：
（一）、优点
1、在水中溶解度大，其饱和溶液含有大量盐；
2、在水中的溶解度受温度的影响很小；
3、一般不会引起蛋白变性。
（二）、缺点
提取的纯度较差，所以只能用它作为粗提。
饱和硫酸铵溶液配法：
取760g～800g硫酸铵，放人70～80℃蒸馏水1000mL中，搅拌约20min，室温静置过液，硫酸铵结晶析出，即上清为饱和硫酸铵，再用NH40H调pH为7.0。
六、实验内容
（一）稀释血清
向血清中加入生理盐水，做1︰1稀释，主要目的，以防蛋白质溶液浓度过稠，引起其它蛋白质共沉，或局部蛋白质变性。
（二）用50%饱和度硫酸铵提取免疫球蛋白
将用生理盐水按l︰1稀释的动物血清置于三角烧瓶或烧杯中，在电磁搅拌器不断搅拌下，逐滴加入与稀释的蛋白液等量的饱和硫酸铵（血清1体积+生理水1体积+饱和硫酸铵2体积），搅拌的目的是为了防止局部硫酸铵浓度过高。搅拌后，室温放置0.5～1h，或置4℃冰箱过夜，次日取出，以每分钟4000转离心30min（离心管周围加冰块或冰水），离心后弃上清（内含白蛋白等），沉淀物中即含γ和β球蛋白。
硫酸铵溶液的饱和度是指在整个溶液中所占的百分比，与原蛋白液的浓度无关。
分子量大的蛋白质先沉淀，分子量小的蛋白质后沉淀，球蛋白的分子量20～30万，而白蛋白的分子量只有69000，所以50%饱和度硫酸铵沉淀的是球蛋白，而白蛋白则留在上清液中。
（三）用33%饱和度硫酸铵提取血清中的γ球蛋白
当血清中饱和硫酸铵为50%饱和度时，沉淀三次，仍含有大量的α、β球蛋白及极少量的白蛋白，当硫酸铵饱和度由50%减少到33～35%时，沉淀蛋白质中的α、β球蛋白和白蛋白的含量相应逐渐减少，而γ球蛋白的纯度逐渐提高，第三次沉淀物只含有少量的α、β球蛋白及白蛋白。
用生理盐水或 PBS将沉淀物搅拌溶解，其溶成原血清体积（1体积），向其中滴加饱和硫酸铵1/2体积。使硫酸铵饱和度为33%，边滴边搅拌，冰相中静置O.5～1h，同上法离心，弃上清（a、β球蛋白），按上述步骤再重复二次，即33%饱和度硫酸铵反复提取三次，即可获得
表1 从不同种动物血清中提取y球蛋白所用硫酸铵浓度和沉淀次数
血清来源
硫酸铵饱和度%和沉淀系数
血清来源
硫酸铵饱和度%和沉淀次数
家兔
绵羊
马
山羊
牛
35×3
35×3
30×3
30×1 45×1
35×3
猪
鸡
豚鼠
小白鼠
大白鼠
35×3
35×3
35×1 40×2
35×1 40×2
35×3
较纯的γ球蛋白。一般来说，蛋白质溶液中的饱和硫酸铵浓度达到即33%时，γ-球蛋白被沉淀出来。但从不同动物的血清中分离γ球蛋白的最适饱和硫酸铵浓度和沉淀次数不完全相同。从各种动物血清中制备γ球蛋白所需的硫酸铵浓度和次数如下表。
（四）脱 盐
免疫血清经硫酸铵提取后，其蛋白液中含有大量硫酸铵，必须除去，常用的方法有透析法和葡聚糖凝胶过滤法两种。
1、透析袋除盐法：半透膜具有使小分子或离子透过而蛋白质分子不能通过的特性。一般先用蒸馏水冲洗透析袋（也可用玻璃纸），用橡皮筋或细绳结扎透析袋的一端，检查无破口后，加入拟脱盐的蛋白液（33%饱和度的硫酸铵沉淀后的蛋白，用原血清量10～20%的生理盐水溶解），装完蛋白液，排出空气，留一定空隙。扎好另一端。开始先用蒸馏水透析过夜，水量至少是蛋白液的50 倍，然后移至PBS或生理盐水中，置4℃透析2～3d，每天换液二次以上，用氯化钡溶液检查SO42+，用奈氏（Nessler′s）试剂检查NH+。
2、 SepadexG25过柱除盐法：SepnadexGl0、15、25或50系细孔凝胶，可排阻所有蛋白质，而盐类可自由进入，用此法可方便地将蛋白质和盐分成两个组分，常用G25或G50除盐，使用的层析柱一般是2.5×25～50cm。凝胶的预处理、装柱、平衡等与一般方法相同。
七、实验步骤
八、注意事项
1、操作过程可以在室温下进行，但温度不宜太高，应尽量在较低温度下进行，避免蛋白质活性丧失；
2、盐析前，血清要用等量的PBS（0.01mol/L pH7.2）或生理盐水稀释，可以减少其他蛋白质与γ-球蛋白的共沉现象。蛋白质含量低于3%时可不稀释；
3、混有铁离子的硫酸铵须除去铁离子。方法是用15N NH40H凋pH至9，加热，产生棕红色沉淀，用滤纸滤除，再加稀硫酸（硫酸:水=1:2），调pH7.0～7.2稳定24h后再用；
4、饱和硫酸铵应逐滴加入，边加边搅，以减少局部高浓度硫酸铵所引起的共沉现象，搅拌速度不宜过快，以免产生泡沫；
5、蛋白质被沉淀后应在冰箱放置过夜，使能结成较大的沉淀块而易于分离。分离（离心沉淀或过滤）沉淀物应在4℃条件下进行，以免蛋白质变性；
6、以上程序（50%饱和度1 次，33%2～3次）可获得较纯的γ球蛋白，有时尚有混少量的β球蛋白；
7、如提纯材料为血浆，则先应除去纤维蛋白质，方法是：先加入2.0%饱和度的硫酸铵，沉淀纤维蛋白质，离心沉淀除去之，然后继续加硫酸铵至50%饱和度，以沉淀球蛋白。
九、结果判断与讨论
抗原免疫动物后获得的抗血清，效价可用上述相应试验判断；其特异性则可通过双扩、免疫电泳或交叉凝集试验进行考察。此外，抗血清的外观应该为澄清、力求无溶血、无血液有型成分残留和无细菌等微生物污染。
附：实验动物的抓取、固定和注射方法
在生物制品学实验中，常常用到实验动物。进行实验时，首先要限制动物的活动，使动物保持安静状态，才便于抓取和固定。固定动物的方法依实验内容和动物种类而定。在抓取、固定动物前，应对实验动物的习性有所了解。在抓取过程中，既要胆大心细，又要准确敏捷，不能粗暴，确实达到抓住和固定的目的。在生物制品学实验中，为了制备抗体或观察药物对机体免疫功能的影响，需要将抗原或药物注入动物体内。注射的途径和方法多种多样，应根据实验目的，实验动物种类和药物剂型，抗原的性质来确定。
1、皮下注射法（subcutaneous injection，sc，以豚鼠为例）
1）助手用左手夹持动物肩部，并用大拇指钩住下颌部，将动物提起，右手在下方将动物托起，手心向上，用食指、中指及无名指夹住后腿；
2）用碘酒和酒精棉球消毒豚鼠蹊部。注射者将皮肤提起，以预先准备好的注射器针头（内装无菌生理盐水）刺入皱褶底部，注射0.5mL。注入时阻力不大而放下皮肤后，皮下呈扩散状隆起者为注射正确。
2、皮内注射法（mtracutaneous injection，ic，以豚鼠为例）
1）助手按上法将豚鼠抓紧；
2）实验者在其腹部任选约2cm2的面积剪毛，消毒皮肤；
3）将5号针头连接在1mL的注射器上，吸取无菌生盐水，针空向上平刺人皮内，注入 0.1~0.2mL，如准确注射在皮内，则注射部位形成坚实的水泡。
3、腹腔注射（intraperitoneal injection，ip，以小自鼠和家兔为例）
小白鼠：
1）用右手拖鼠尾，使其爬行于较粗糙之台面上，再突然用左手拇、食指抓紧小白鼠颈项及其两耳，翻转后，用左手无名指及小指夹住鼠尾及后肢；
2）消毒腹壁，以预先准备的材料（无菌生理盐水）注入腹腔0.3mL。
注意：注射时应将小白鼠的头部向下，以避免针头刺人内脏。针斜刺入皮肤后，转直，再向下直刺少许即可进入腹腔，其目的是使两个针眼不在一条直线上，可避免拔出针头时注射材料流出污染皮肤及造成注射剂量不足，在注射传染材料时，应特别注意。另外，进针部位不宜太近上腹部或进针过深，以免刺破内脏。
家兔：
1）将家兔四肢固定在解剖台上腹部朝上；
2）在下腹部略靠外侧（腹部下约1/3处，避开肝和膀胱），消毒该处皮肤，将针头垂直刺入腹腔，将针筒略为回抽，如无血液或尿液，即可进行注射。注入1mL无菌生理盐水。
4、肌肉注射（intramuscuLar injection，im，以小白鼠为例）
此法用得较少，常用于给动物注射混悬于油或其他溶剂的药物时。肌肉注射部位，应选择丰满且无大血管通过的肌肉，一般采用臀部．亦常取大腿内（外）侧，颈椎或腰椎旁的肌肉进行注射。注射时，将注射部位的被毛剪去（小动物可不剪毛）。注射器连61/2号针头，由皮肤表面垂直刺人肌肉，略回抽如无回血，即可注射。给小白鼠作肌肉注射时，用左手抓住鼠两耳及头部皮肤，右手取连有51/2号针头的注射器，将针头刺入大腿外侧肌肉，注入0.2mL无菌生理盐水。
5、静脉注射（intravenousinjection，iv，以家兔和小白鼠为例）
家兔：
1）捉兔时，轻开笼门，勿让兔受惊。将手伸入笼内，于兔头前面阻拦其跑动，当兔匍匐不动时，右手抓住颈部皮肤将兔提起，左手随之托住其臀部，不正确的抓取方法：①易伤两肾。②易造成皮下出血。③可伤两耳。正确的抓取方法：抓住颈后皮肤，并用手托起。
2）将家兔固定于特制木箱中或由助手按在桌上（一手轻轻按其颈部，一手轻扶耳根，使耳向前）。剪去或拔去兔耳缘部被毛；
3）用棉球或少许纱布沾取45～50℃的温水于耳翼边缘的血管上，或用手指轻弹并轻揉兔耳，使静脉充血，助手以一手将耳根固定；
4）注射者以左手持该耳，右手将预先准备的材料（无菌生理盐水）出血管注入，针头刺入时与静脉几乎相平行，注入0.5mL。如注射正确，则针下阻力较小，亦可见血管变色；如阻力较大或皮下隆起即停止注射，重新刺入血管，或另选部位；注入液体时应将针头与耳同时固定，以免针头退出血管；
5）注射完毕用消毒干棉球压住注射部位，然后拔出针头，再压片刻以防出血。
小白鼠：
1）将小白鼠置小试管篓中，鼠尾自网眼中露出；
2）将鼠尾浸于盛45~50℃温水的试管中1～2min或用棉花沾温水揉擦尾部使尾静脉充血，可见三根暗红色的尾静脉;
3）选最明显的一条尾静脉，用左手三指捏住鼠尾，在距尾尖 2～3cm（此处皮薄脉浅，易刺入）进针，针头与尾静脉几乎相平行，注入无菌生理盐水0.3mL。其余操作同兔耳静脉注射。
6、胃内注入法（灌胃法，ingestion，ig，以小白鼠为例）
1）用左于拇指及食指抓住小鼠两耳及头部皮肤，另三指抓其背部皮肤，翻转，使其腹部朝上，头部向上保持一定的倾斜度;
2）右手持连有灌胃针头的注射器，将针头对准正中线插人口腔，沿咽后壁中线慢慢向后，向下插入。亦可沿鼠右侧嘴角插入，经食道进入胃内。若遇阻力则后退稍许再慢慢进针，插入2～2.5cm即可到达食道下端，注入0.5mL无菌生理盐水。注入时如通畅，表明针头已插入食道；如不通畅，动物有呕吐动作并挣扎，则表明针头未插入食道，应立即拔出，按上法重新操作。
灌胃法的要点在于：小鼠要固定好，头和颈部保持极平，进针方向正确，—定要沿正中线或右口角进针，再顺着食道慢慢插入，不可硬往里插，否则注入肺内，造成死亡。
注射器的准备与消毒
1、选择大小适宜而注射针筒与筒芯号码一致的注射器，并先吸入清水，试其是否漏水，漏水的注射器不能使用，因其注射量不准确，且易引起污染及传染；
2、视选择的动物及注射途径之不同而选用不同长短大小的针头，并先试验是否通气或漏水；
3、消毒时将筒芯从筒中拔出，用脱脂纱布以相同的方向先包针筒后包筒芯，置煮沸消毒器中，选好针头，包好纱布置煮沸消毒器另一端，同时放入镊子一把，加入自来水，以覆盖注射器为度，煮沸10min（从水沸之时算起）；
4、消毒完毕后，用镊子取出注射器，置筒芯于针筒中，针头牢固地装在针筒的针嘴上，使其斜面与针筒上的刻度方向一致，吸入注射材料，准备注射；
5、若使用一次性注射器，则不必消毒，买来即可使用。
注意事项
1、吸入注射材料后，应将注射器内的空气排尽，若注射材料具有传染性，则排气时应以酒精棉球包住针头，以免传染材料流出；
2、注射完毕后，如注射材料具有传染性，应以消毒器中的水抽吸几次，然后取下针头，抽出筒芯放入消毒器中与抽吸洗过的水一并煮沸消毒，煮毕后洗净注射器及针头置干燥箱中烘干后，分别收藏备用。
