南京大学李金波&张艳&方雷：基于共价疏水标记策略靶向降解DNA/RNA结合蛋白
近日，南京大学李金波、张艳和方雷等人合作开发了一种可用于DNA/RNA结合蛋白（DBP/RBP）靶向降解的共价疏水标记策略（LACHT）。在非共价蛋白配体辅助下，LACHT利用反应性N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）连接基团在蛋白靶标表面共价标记疏水性金刚烷，从而进一步通过细胞内质量控制系统诱导DBP/RBP降解。利用小分子非共价配体，作者在人白血病细胞中证明了LACHT可介导DBP-含溴结构域蛋白4 （BRD4）的高效降解。此外，LACHT也可通过使用RNA配体成功将RBP-Lin28a靶向降解，导致其下游let-7 miRNA表达上调。因而，本研究提供了一种针对DBP/RBP的靶向降解新工具，其同时也广泛适用于其他难以靶向蛋白质。
背景介绍：
DBP和RBP在控制或调节基因表达方面起着至关重要的作用，也是潜在的有效治疗靶点。然而这些蛋白由于大多数缺乏小分子配体结合袋而长期以来被认为是“不可成药”靶点。靶向蛋白降解（TPD）是一种新兴的、在生物学研究和治疗发展方面具有广阔前景的方法，有潜力解决传统上无法治疗的蛋白质靶点。蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）作为一种典型的TPD平台，由一个靶蛋白配体和一个E3泛素连接酶招募模块组成，通过诱导泛素-蛋白酶体途径降解靶蛋白。PROTACs的开发与多种靶蛋白配体兼容，如小分子、多肽和寡核苷酸等。因此，即使缺乏小分子配体，但也有报道PROTACs成功利用DNA或RNA底物等作为配体靶向降解如转录因子、G-四链体结合蛋白以及RBP。然而由于目前PROTAC可利用的E3连接酶/配体对数量有限，并且其降解效率依赖于募集连接酶的表达和分布，因此PROTACs的应用局限于表达必要连接酶的细胞类型。
疏水标记是一种可以避免对特定E3连接酶的依赖的TPD策略。疏水标记由一个小分子靶蛋白配体与一个高度亲脂性的片段连接而成，具有单特异性，从而规避了PROTACs所依赖的异源特异性。在配体引导下与靶标结合，疏水性片段模拟蛋白质错误折叠状态，激活细胞蛋白质量控制系统引发蛋白降解。这种方法已被用于降解多种内源性蛋白靶标。虽然前景可观，但疏水标记很少用于降解DBP或RBP。这可能是由于疏水标记更倾向于高亲和力甚至共价的靶蛋白配体，以实现高疏水性部分与蛋白质的稳定结合，从而促进降解过程。然而，DBP和RBP普遍缺乏高亲和力的小分子配体，其中许多只有低亲和力的DNA和RNA底物配体用于靶向。因此推进基于疏水标记的DBP和RBP靶向降解是非常必要的。
本文亮点：
本文中，作者报告了一种新的配体辅助共价疏水标记（LACHT）策略，用于DBP和RBP的TPD（图1）。受配体导向化学的启发，利用反应性亲电连接基团对靶蛋白进行不可逆共价标记，作者使用NASA作为可切割反应片段连接，将非共价靶蛋白配体与疏水标签结合。NASA因其快速反应动力学和高标记效率和特异性而被选中在NASA介导的共价键形成和配体的释放后，交联疏水标签劫持了细胞蛋白质的质量控制机制，从而导致蛋白质水解降解。本研究开发的LACHT策略具有应用广泛性，极大地扩展DBP和RBP靶向TPD应用范围。
为了证明LACHT的可行性，作者选择了作为DNA结合转录因子的溴结构域和超末端外 (BET)家族作为示例靶点，选择JQ1作为针对BET家族蛋白BRD4的非共价小分子配体，金刚烷作为疏水标记，设计了4种小分子降解剂SMD1-4。在体外溶液中利用LC-MS验证SMDs成功共价标记BRD4后，作者证明了该策略成功在细胞中靶向降解内源BRD4。MV4-11细胞经SMD1处理后，BRD4呈时间依赖性和SMD1浓度依赖性的高效降解，定量蛋白质组学分析也证明了LACHT的BRD4选择性降解。
为了探究LACHT降解机制，通过抑制剂实验的结果显示，LACHT作用同时依赖于蛋白酶体和溶酶体途径，His-泛素 (His-Ub)下拉实验显示SMD1诱导BRD4的多泛素化。
在验证LACHT策略靶向降解DBP的可行性之后，作者通过靶向RBP Lin28a来验证LACHT方法的普适性。Lin28a是一种RNA结合蛋白，可以抑制let-7 miRNA的产生以促进肿瘤的发生。作者选择更换RNA底物片段作为配体合成降解剂OND6，结果显示OND6呈剂量依赖性地降解K562细胞中的Lin28a，并上调let-7家族miRNA（图5）。
总结与展望：
综上所述，本研究工作开发了一种LACHT策略作为针对DPB和RBP的通用降解方法。LACHT利用NASA的弹头来避免对高亲和力或共价配体的需要，从而极大地拓宽了疏水标记技术的适用范围。同时，LACHT的单特异性可以避免PROTACs策略对E3连接的依赖。另外，LACHT可以适用于不同的蛋白质靶点进行模块化设计。总之，本工作提供了一个可用于扩展生物医学应用的靶向蛋白降解新工具。
