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不同直链淀粉和抗性淀粉品质相关性试验

2018.12.04

　　淀粉主要分为支链淀粉和直链淀粉，其中直链淀粉的聚合度一般在500~6000个葡萄糖残基，支链淀粉由三种链构成：A链、B链和C链。C链为主链，有一个还原末端，聚合度一般在60个葡萄糖残基以上；B链是C链上的支链，聚合度一般为45~55个葡萄糖残基；A链是B链上的支链，聚合度一般为14~18个葡萄糖残基[24].普鲁兰酶作用于A-1, 6糖苷键，将支链水解下来。直链淀粉含量的测定是根据A-1, 4葡聚糖与碘形成蓝色复合物的反应，以分光光度法或电位滴定法进行测定。

　　电位滴定法是一种碘亲合力的测定法，但是测定步骤较多，操作复杂，由于分光光度法准确、简便、快速，所以得到更广泛的应用。分光光度法已被研究许多年，起初是为了配合高直链型玉米淀粉玉米品种的研究，以后得到广泛应用[5].Wolf法（1970）[6]是利用了90% DMSO对淀粉的良好的溶解能力。Knutson（1986）[7]进行了改进，利用了碘溶解于DMSO时自发形成的三离子（I-3），该离子是直链淀粉-碘复合物形成的前提。具体步骤是将淀粉试样溶解于I-2DMSO溶液中，然后用水稀释，形成直链淀粉-碘复合物，然后于600nm下测光密度。

　　该法的最大优点是可将脂类的干扰降低至最小限度。最近，Knutson（1994）[8]对该法又进行了改进，利用低温糊化和超声处理快速溶解研磨的淀粉试样，使测定时间大为缩短。该方法在许多实验室得到应用，除测定直链淀粉含量外，也用于测定合成的直链淀粉的聚合度[9].Akerberg和Bjock等人发现[1],在低温长时间焙烤条件下，高直链型大麦面包比普通小麦面包含有更多的抗性淀粉。

　　本实验的目的是研究直链淀粉和支链淀粉对抗性淀粉形成有何影响。

　　1 材料与方法

　　111 材料与仪器

　　普通玉米淀粉市售；高直链型玉米淀粉国民淀粉公司；胰腺A-淀粉酶 A-3176, Sigma公司；胃蛋白酶 P-7000, Sigma公司；耐高温A-淀粉酶Termamyl120L,丹麦Novo公司；葡萄糖淀粉酶AMG 300L,丹麦Novo公司；普鲁兰酶 Promozylme400L,丹麦Novo公司。压热反应器定制；电子分析天平 FA1104型，上海天平仪器厂；直链淀粉分析仪，浙江托普仪器有限公司；紫外-可见分光光度计 UV-754型，上海分析仪器厂；恒温振荡水浴 HSZ-1型，江苏太仓医疗器械厂。

　　1.2 实验方法

　　11211 直链淀粉的提取和纯化提取和制备直链淀粉纯品的具体步骤参照Patil和Takeda的方法[10~12],经7次重结晶。

　　11212 直链淀粉纯品的鉴定1121211 碘亲和力的测定-碘电位滴定法当淀粉（包括直链淀粉和支链淀粉）溶液用碘进行电位滴定时，在碘与淀粉分子形成络合物期间基本没有电位变化，但一旦有游离碘出现，电位会升高，因而可从电位滴定曲线求出形成淀粉-碘络合物所结合的碘量。碘亲和力是随着淀粉的植物来源不同而有差异，每一种淀粉都有其特定的碘亲和力值，其值的大小主要取决于淀粉中直链淀粉的含量，所以常用碘亲和力来确定淀粉中直链淀粉的含量[13]及做为评定直链淀粉纯度的一项指标[14].按Schoch法[15]测定，然后按式（1）计算。

　　碘亲和力=结合碘的毫克数（Y轴的截距）@100样品干重（mg）式（1）1121212 蓝值的测定蓝值是表示淀粉结合碘能力的另一个指标，直链淀粉由于其线性聚合度很高，故蓝值很大，一般为018~112.支链淀粉的侧链链长只有14~30葡萄糖残基，则蓝值在0108~0122之间[16],所以也是评定直链淀粉的纯度一项指标。测定方法采用Gilbert和Spragg法[17],然后按式（2）计算。

　　蓝值=A680@4样品的浓度（mg/dL）式（2）1121213 凝胶渗透色谱[25] 是评定直链淀粉纯度的一项重要指标。采用Sepharose CL-2B柱，<110@115cm.

　　1121214 直链淀粉平均数均聚合度DPn的测定参照文献[26].

　　1121215 紫外-可见吸收光谱参照文献[26].

　　11213 直链淀粉含量的测定参照Knutson提出的改进方法[7].

　　11214 淀粉的酶法脱支称取10g淀粉于1000mL三角瓶中，加100mL 2mol/L KOH溶液，边搅拌边缓慢加入200mL水。沸水浴40min,振荡（170次/min）。然后流水冷却，加约115mL 2mol/L HCl溶液，加30mL 014mol/L pH4175NaAc缓冲溶液，加0.5g苯甲酸钠，加数滴2mol/LHCl溶液，调pH至417,加300LL Promozylme 400L, 60e水浴，恒温48h,振荡（120次/min）。然后流水冷却，加2~4倍体积95%乙醇，静置5h以上，真空抽滤（2号砂芯漏斗）， 60%~80%乙醇洗涤5次，无水乙醇洗涤3次， 50e烘24h,研磨，过筛（100目）。

　　11215 压热实验取一定量的淀粉，加入一定量的水，搅拌均匀，盖上铝箔，放入压热反应器中，加热至一定温度，保持一定时间后，取出，自然冷却， 80e烘18h.粉碎，过筛（80目）。

　　11216 抗性淀粉的定量测定参见文献。

　　2 结果与讨论

　　2.1 直链淀粉纯品的纯度

　　经7次重结晶获得的直链淀粉纯品的平均聚合度DPn=890,远远小于支链淀粉的分子量下限2@107.测得其蓝值为11082,碘亲和力为1910,都在直链淀粉的范围内。SepharoseCL-2B的分子量分级范围是110@105~210@107,能排阻分子量大于210107的级份。将直链淀粉纯品试样上SepharoseCL-2B层析柱，得到GPC图谱（图1）。

　　从图1看到，在外水体积没有任何峰，证明支链淀粉已基本被除去。综合上面的结果，可以得出结论：直链淀粉纯品的纯度很高，能满足做为标样的要求。

　　2.2 直链淀粉含量的测定

　　使用分光光度法测定直链淀粉含量，首先要用直链淀粉纯品制作直链淀粉的标准工作曲线。

　　回归方程： y=342113x+011766相关系数： Y=019996从直链淀粉标准曲线（图2）看到，直链淀粉的量与600nm处的光密度呈显著的线性正相关。

　　2.3 直链淀粉含量对抗性淀粉形成的影响

　　为了考察不同直链淀粉含量对抗性淀粉得率的影响，用纯直链淀粉和纯支链淀粉按不同比例配成不同含量的混合物，直链淀粉含量分别为0%、20%、30%、50%和70%,然后在同样的条件下进行压热处理，结果如图3所示。很明显，随着直链淀粉含量的增大，抗性淀粉的得率不断上升，二者为明显的正相关。表明直链淀粉含量的增加，促进了抗性淀粉的形成，这与Sievert的结论完全一致[18].

　　为了更清楚地了解支链淀粉和脱支处理对抗性淀粉形成的影响，对原玉米淀粉和脱支的淀粉同时进行压热处理，结果如表1所示。表1表明，一些支链淀粉经脱支后，直链淀粉含量有明显提高。由于在脱支处理前原淀粉已完全糊化，并经沸水浴40min,所以已有部分抗性淀粉形成，其含量达到7139%,与回生的淀粉相近，而且直链淀粉含量也提高至3519%.经压热处理后，直链淀粉进一步结晶，使抗性淀粉含量提高至13161%,增加了84%.这不但证明直链淀粉是形成抗性淀粉的关键，而且也证明支链淀粉的减少有利于抗性淀粉的形成，这与有关文献一致[2].Sievert认为，支链淀粉明显地限制了直链淀粉链的有序排列，导致抗性淀粉得率降低[18].

　　所以，增加直链淀粉含量及减少支链淀粉含量对抗性淀粉的形成有利，同时也表明仅直链淀粉参与了抗性淀粉的形成。与直链淀粉比较，支链淀粉的结晶是一个极其缓慢的过程，常常持续几天，甚至几十天。而且，较长的A链可在一定程度上形成氢键。

　　由于支链淀粉晶体的熔融吸热峰在60e左右，容易在沸水浴下熔融，并被耐热型淀粉酶水解，所以不能参与抗性淀粉的形成[19].Jane和Robyt等人[20]认为：在淀粉回生过程中，直链淀粉可以形成有40~70个葡萄糖残基的双螺旋[21,22].而支链淀粉由于受到分支结构和支链长度的影响仅形成较短的双螺旋。