钩吻素子对大鼠焦虑行为的影响

摘要 ： 目的 进一步明确钩吻素子是否具有抗焦虑作用 。 方法 以大鼠高架十字迷宫实验为动物模型 ，评价钩吻素子单次皮下注射给药和连续皮下注射给药的抗焦虑活性及特点 。 结果钩吻素子能显著增加大鼠进入高架十字迷宫开臂次数和在开臂的停留时间百分率（P＜ ０ ． ０５ ，P ＜ ０ ． ０１） ；钩吻素子在实验剂量下对大鼠自主运动活性无影响（P ＞ ０ ． ０５） 。 结论 钩吻素子可能具有抗焦虑作用 。

关键词 ： 钩吻素子 ； 焦虑 ；高架十字迷宫

焦虑症（anxiety  disorders）又名焦虑障碍，或者焦虑精神性疾病，是一类以发作性或持续性情绪焦虑和紧张为主要特征的精神性疾病。焦虑症的发病率逐年上升，严重影响了人们的生活质量。药物治疗是目前应用最广泛、最有效的治疗手段。然而，经典的一线抗焦虑药在治疗焦虑症的同时，往往具有药物依赖、镇静、性功能障碍等不良反应，使其临床应用受到限制，因此，亟待研发有效安全的新型抗焦虑药。钩吻为马钱科胡蔓藤属植物，中国钩吻盛产于闽、桂、浙等地，其主要成分为吲哚类生物碱，含有数十种生物碱单体，其中钩吻素子（koumine）为国产钩吻生物碱单体中含量最高的一种有效成分。本实验室前期采用小鼠高架十字迷宫实验和明暗穿梭箱测试方法，首次观察到钩吻素子具有显著的抗焦虑作用。然而，钩吻素子抗焦虑作用有待于在更多的焦虑动物模型上确证。本文拟在此基础上，  采用单次给药和连续给药２种给药方式，考察钩吻素子在大鼠高架十字迷宫模型中的抗焦虑作用及其特点。

1 仪器与材料

1.1 仪器  XR-XG201型 大鼠高架十字迷宫（由上海欣软信息科技有限公司提供）

1．2试药钩吻素子粉末，由本课题组分离纯化，并经高效液相色谱鉴定，质量分数为９９．２％，临用时用生理盐水配成所需质量浓度的溶液；地西泮注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号１０１０１８１，用生理盐水配成所需质量浓度的溶液，新鲜配制。

1．3动物清洁级雄性Wistar大鼠，体质量１８０～２００g，许可证号：SCXK（沪）２０１２‐０００２，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。在光暗周期１２／１２h（光照时间８：００～２０：００）、恒湿度（５０％±５％）、恒温（２４±２℃）环境饲养，自由进食和饮水，每２d换１次垫料，动物室保持安静。实验前７d每天抚摸大鼠１～２min，减少无关刺激对实验的影响。给药前１h将大鼠移至实验室，使之熟悉环境，消除陌生环境对大鼠的影响。所有针对大鼠的实验操作均遵守国际和本地实验动物使用和保护委员会颁布的条例。

2方法

2．1动物分组及给药大鼠随机分为对照组（生理盐水）、地西泮（diazepam，DZP）阳性对照组（０．５mg·kg－１）及钩吻素子０．７５，１．５和３mg·kg－１剂量组，每组７～１９只大鼠，按０．００５mL·g－１颈背部皮下单次量注射给药１h后，于９：００～１３：００进行行为学测试；另取大鼠随机分为对照组（生理盐水）、DZP组（０．５mg·kg－１）及钩吻素子０．１８７５，０．７５，１．５和３mg·kg－１剂量组，每组７～１５例。０．００５mL·g－１，颈背部皮下注射给药，每天１次，连续７d（其中DZP组则第１～６d给予等体积生理盐水，第７d给予DZP０．５mg·kg－１），各组于d７末次给药１h后于９：００～１３：００进行行为学测试。

2．2行为学测试将实验动物迅速置于迷宫的中央开阔部，使其头部正对其中一个开臂，通过上方的摄像机拍摄５min内动物的活动情况，记录下述指标：①封闭臂进入次数（closearmentry，CE）；②开放臂进入次数（openarmentry，OE）；③开放臂停留时间（openarmtime，OT）。通过以上行为学指标分别计算下列指标：动物进入开放臂和封闭臂的总次数（to‐talarmentries）；动物进入开放臂次数比例（OE％），即OE／（CE＋OE）×１００％；动物在开放臂停留时间比例（OT％：OT／总时间×１００％）。

2．3统计学处理采用SPSS１３．０forWindows软件对实验数据进行计算。数据用均数±标准误（mean±S．E．M）表示，两组间均数比较采用双侧t检验，多组数据间采用one‐wayANOVA方法进行统计处理，差异有显著性时再用LSD‐posthoc进行统计分析。P＜０．０５为差异有统计学意义。

4讨论

目前，焦虑动物模型包括各种改进型多达３０种以上，其根据行为模式主要包括两大类：基于动物非条件反射的模型和基于条件反射（传统学习模式）的模型。高架十字迷宫实验（elevatedplus‐mazetest，EPM）是基于动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成的动物矛盾冲突状态的原理，建立的非条件反射模型，是目前应用最广泛的检测动物焦虑行为的经典模型之一，在精神药理学研究中应用广泛。随着精神药理学的发展，EPM除了用于大鼠、小鼠的焦虑行为，还可用于评价同属于啮齿类的其他动物焦虑行为，如豚鼠。评价药物是否具有抗焦虑作用，需在多种模型上从多个角度验证。因此，本文选用大鼠高架十字迷宫模型，进一步评价钩吻素子的抗焦虑作用。在EPM中，动物进入开臂次数和在开臂滞留时间，充分地反映了动物的焦虑状态，相比之下，总入臂次数则反映了动物的运动活性。同时，我们也发现基于动物非条件反射行为基础建立的EPM模型，在整个实验过程中很容易被实验条件影响，例如：实验动物的选择（种属、年龄、性别、健康状态）、动物对环境的适应、实验条件基本保持一致（实验操作者、灯光、气味）、饲养条件、测试时间等。地西泮是经典的苯二氮类抗焦虑药物，其起效快，作用显著，是焦虑动物模型中最常用的阳性对照药之一，在单次给药和连续给药EPM模型中，我们均可观察到地西泮能够显著提高动物开臂的进入次数以及在开放臂的停留时间，与文献报道一致，说明模型稳定。

有研究指出，北美钩吻总生物碱在剂量为１５０mg·kg－１时，能显著性地提高小鼠在高架十字迷宫中进入开放臂的次数和时间。在小鼠明暗穿箱实验中发现，北美钩吻总生物碱能显著提高小鼠在明箱中的停留时间和明暗箱穿梭次数，显示出显著的抗焦虑作用。钩吻生物碱单体钩吻素甲和钩吻素子在小鼠明暗穿箱模型中，也显示出显著的抗焦虑作用。此外，钩吻素子与其他钩吻生物碱单体相比，毒性相对较小（小鼠LD５０为９９．０mg·kg－１，sc），初步提示了钩吻素子可能具有高效、低毒的抗焦虑作用。在此基础上，本文采用大鼠高架十字迷宫为动物模型，从不同角度进一步探讨钩吻生物碱中钩吻素子的抗焦虑作用和特点。

文中结果提示，钩吻素子在大鼠高架十字迷宫模型中呈现出与地西泮一致的抗焦虑作用，作用呈剂量依赖性。有趣的是，我们发现在大鼠高架十字迷宫单次给药和连续给药时，钩吻素子的抗焦虑作用并不是呈经典的线性关系。其原因可能是钩吻素子在一定范围内达到了抗焦虑作用的最大效应，其抗焦虑作用不再随着药物剂量的增加而增强，所以出现与焦虑相关的脑区对高剂量钩吻素子反而不敏感。由此可见，在应用钩吻素子抗焦虑时要严格控制其剂量。此外，我们还观察到钩吻素子对动物的运动活性并无显著影响，说明其发挥抗焦虑作用的同时，无镇静催眠作用。

综上所述，钩吻素子可能有抗焦虑作用，并具有高效、低毒的特征，有望成为治疗焦虑症的新型药物。鉴于焦虑动物模型的多样性，其抗焦虑作用还有待于在更多的模型上确证，其抗焦虑作用的机制也有待探究。