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毛细管电泳(HPCE)的工作原理

2020.8.11

  本应用简报按照 Agilent SureSelectQXT WGS 文库制备方案,介绍了 Agilent 4200 TapeStation 系统在工作流程中的样品质量控制 (QC) 性能。基因组 DNA ScreenTape 分析法是对基因组 DNA 起始材料进行系列定量分析并提供完整性信息的可靠方法。安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法可在测序前对扩增的标签文库进行分子量测定和定量分析。数据还表明,采用 DNA ScreenTape 分析法所获得的结果与使用 Agilent 2100 生物分析仪系统和 Qubit 荧光计进行分析所得到的信息相一致。

  前言

  Agilent SureSelectQXT 全基因组文库制备试剂盒可生成用于 Illumina 配对末端多重测序的文库。SureSelectQXT 文库制备对基因组 DNA (gDNA) 的起始量变化非常敏感。本方案建议使用 Qubit 仪器进行两次系列荧光分析来定量。采用基因组 DNA ScreenTape 分析法在 Agilent 4200 TapeStation 系统上运行相同样品,比较这两种方法所获得的结果。gDNA 起始量的偏差会导致所得片段分布不理想,使扩增文库中过大或过小的 DNA 片段所占比例过高。这种效应可以通过由各种 gDNA 起始材料(从低丰度到高丰度)产生的额外文库来说明。

  扩增文库使用安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法及 4200 TapeStation 系统进行分析,将其结果与 SureSelectQXT 方案推荐的高灵敏度 DNA 分析法及 Agilent 2100 生物分析仪系统分析所得结果进行比较。

  扩增文库的分析结果显示,高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析与 2100 生物分析仪系统获得的分子量和摩尔浓度结果相一致。

  材料与方法

  4200 TapeStation 系统 (G2991AA)、2100 生物分析仪系统 (G2939AA)、SureCycler 8800 热循环仪 (G8800A)、用于 WGS 的 SureSelectQXT 文库制备试剂盒 (G9682A)、高灵敏度 D5000 ScreenTape (5067-5592) 和试剂 (5067-5593)、基因组 DNA ScreenTape (5067-5365) 和试剂 (5067-5366)、高灵敏度 DNA 试剂盒 (5067-4626),以及 OneSeq 参比 DNA 男性 (5190-8848) 购自安捷伦科技公司。NanoDrop 1000、Qubit 3.0 荧光计 (Q33216) 和Qubit dsDNA BR 分析试剂盒 (Q32850) 购自赛默飞世尔科技公司。使用区域功能来实现 DNA 文库的定量测定。除非另有说明,否则所有分析均按照生产商的方案和指南进行。

  结果与讨论

  图 1 说明了使用 gDNA 作为起始材料生成全基因组测序 (WGS) 文库的 SureSelectQXT 方案。简而言之,样品在一步酶解步骤中进行碎裂和接头标记,然后进行 PCR 扩增,在此期间对接头连接的片段进行扩增和标记。然后使用磁珠清洁扩增的接头连接的文库,并在测序前分析以确定合适的分子量、数量,并进行纯度(不含接头二聚体产物)评估。

  gDNA 的数量和完整性

  SureSelectQXT WGS 方案需要高质量的 DNA 样品,以获得最佳性能和 gDNA 起始材料的精确定量结果。按照该方案使用配有 dsDNA BR 分析试剂盒的 Qubit 仪器进行系列定量分析。将相同的样品在 4200 TapeStation 系统和 NanoDrop 中均进行6次重复基因组 DNA ScreenTape 分析。图2显示了获自 4200 TapeStation 系统、Qubit 和 NanoDrop 的数据,说明了基因组 DNA ScreenTape 分析法适用于对 gDNA 起始材料进行定量分析。采用UV 光谱法测定 gDNA 所得的量常会过高,这是由于其他缓冲液成分在 UV 光谱中也可能有吸收[4]。

  此外,基因组 DNA ScreenTape 分析法可在同一 QC 步骤中客观评价样品完整性。样品完整性由 TapeStation 分析软件的 DNA 完整值 (DIN) 计算功能自动测定(图 3)。

  与其他系统不同的是,基因组 DNA ScreenTape 分析方法及 4200 TapeStation 系统只需 1 µL 样品即可在一步分析中同时对质量和数量进行评价。

  Agilent SureSelectQXT 全基因组文库的片段分子量测定

  除了 gDNA 起始材料的初始质量控制外,SureSelectQXT 方案还建议对扩增文库进行质量控制,从而确保在测序前显示整个片段的分子量范围。片段平均分子量显著小于 600 bp 可能表明碎裂反应中的 gDNA 过少,或者可能与测序数据的重复分析次数增加有关。相反,文库中片段平均分子量过大(超过 1000 bp)可能表明碎裂反应中的 gDNA 过多,并且可能需要更高的 DNA 浓度以在测序反应中获得最佳的群集密度。

  为了证明这一点,制备起始量为 20、50 和 80 ng 的文库,用 50 ng gDNA 样品生成的文库作为标准文库。图 4显示了与 2100 生物分析仪系统相比,4200 TapeStation 系统在评估分子量测定方面的性能,通过用上述起始量对文库进行三次重复区域分析来评估。图中的数据展现了两个系统所得的文库分子量有很好的相关性。

  不同 gDNA 起始量的电泳叠加图显示,使用 2100 生物分析仪 (A) 和 4200 TapeStation (B) 系统,文库片段分子量分布(图 5)呈现出不同的弥散条带曲线。50 ng 的最佳 gDNA 起始量可得到平均分子量在 600–1000 bp 之间的文库曲线。最小的 gDNA 起始量产生的文库通常会导致其分子量范围趋向于更小。相反,gDNA 起始量过大会导致大 DNA 片段比例过高,从而产生的文库的分子量范围趋向于更大。此外,所有电泳图均未显示接头二聚体产物,表明文库纯度很高。

  SureSelectQXT 全基因组文库的定量分析

  对于多重测序,将 SureSelectQXT 全基因组文库合并,使每个插入标记的样品在库中的摩尔量相同。文库的最佳起始浓度取决于测序平台。它可能还需要根据文库的 DNA 片段分子量范围进行优化,以获得所需的最终量和数据质量。4200 TapeStation 和 2100 生物分析仪系统可在区域表中提供摩尔浓度定量数据和分子量信息(图 6)。

  对于每个由不同 gDNA 起始量产生的文库,将其摩尔浓度绘制在两个系统的对比图中(图 7)。

  表 1 中的汇总数据表明,使用高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法得到的扩增文库的分子量和定量分析结果,与 SureSelectQXT WGS 方案推荐的 2100 生物分析仪系统及高灵敏度 DNA 分析法得到的结果相一致。

  结论

  本应用简报证明了 Agilent 4200 TapeStation 是可用于 Agilent SureSelectQXT WGS 文库制备过程中进行样品分析的可靠系统。

  高质量 DNA 样品和 gD毛细管电泳(HPCE)的工作原理

  高效毛细管电泳(high performance capillaryelectrophoresis,HPCE)是近年来发展起来的一种分离、分析技术,它是凝胶电泳技术的发展,是高效液相色谱分析的补充。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等,HPLC分析高效、快速、微量。

  一、电泳迁移

  不同分子所带电荷性质、多少不同,形状、大小各异。一定电解质及PH的缓冲液或其它溶液内,受电场作用,样本中各组分按一定速度迁移,从而形成电泳。

  电泳迁移速度(v)可用下式表示:

  v=uE

  其中E为电场强度(E=V/L,V为电压,L为毛细管总长度)。u为电泳淌度。

  二、电渗迁移

  电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁移动的现象。特殊结构的熔合硅毛细管管壁通常在水溶液中带负电荷,在电压作用下溶液整体向负极移动,形成电渗流。带电微粒在毛细管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。

  三、分离分析类型

  根据其分离样本的原理设计不同主要分为以下几种类型:

  ①毛细管区带电泳(capillary zoneelectrophoresis,CZE);

  ②毛细管等速电泳(capillarychromatography,CITP);

  ③毛细管胶速电动色谱(miceller electrokineticcapillary chromatography,MECC);

  ④毛细管凝胶电泳(capillarygelelectrophoresis,CGE);

  ⑤毛细管等电聚焦(capillary isoelectricfocusing ,CIEF)。

  毛细管区带电泳(CZE)为HPCE的基本操作模式,一般采用磷酸盐或硼酸盐缓冲液,实验条件包括缓冲液浓度、pH值、电压、温度、改性剂(乙腈、甲醇等),用于对带电物质(药物、蛋白质、肽类等)分离分析,对于中性物质无法实现分离。毛细管胶束电动色谱(MECC)为一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液体色谱,在缓冲液中加入离子型表面活性剂作为胶束剂,利用溶质分子在水相和胶束相分配的差异进行分离,拓宽了CZE的应用范围,适合于中性物质的分离,亦可区别手性化合物,可用于氨基酸、肽类、小分子物质、手性物质、药物样品及体液样品的分析。毛细管等速电泳(CITP)采用先导电解质和后继电解质,构成不连续缓冲体系,基于溶质的电泳淌度差异进行分离,常用于离子型物质(如有机酸),并因适用较大内径的毛细管而可用于微制备,但本法空间分辨率较差。毛细管等电聚焦电泳(CIEF)用于具兼性离子的样品(蛋白质、肽类),等电点仅差0.001可分离的物质。毛细管凝胶电泳(CGE)依据大分子物质的分子量大小进行分离,主要用于蛋白质、核苷酸片段的分离。此外,还有毛细管电色谱(CEC)及非水毛细管电泳(CNACE),用于水溶性差的物质和水中难进行反应的分析研究。目前CZE和MECC用得较多,本文以这两种方法为例来说明HPLC的原理。

  四、CZE的基本原理

  HPLC选用的毛细管一般内径约为50μm(20~200μm),外径为375μm,有效长度为50cm(7~100cm)。毛细管两端分别浸入两分开的缓冲液中,同时两缓冲液中分别插入连有高压电源的电极,该电压使得分析样品沿毛细管迁移,当分离样品通过检测器时,可对样品进行分析处理。HPLC进样一般采用电动力学进样(低电压)或流体力学进样(压力或抽吸)两种方式。在毛细管电泳系统中,带电溶质在电场作用下发生定向迁移,其表观迁移速度是溶质迁移速度与溶液电渗流速度的矢量和。所谓电渗是指在高电压作用下,双电层中的水合阴离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象;电泳是指在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。溶质的迁移速度由其所带电荷数和分子量大小决定,另外还受缓冲液的组成、性质、pH值等多种因素影响。带正电荷的组份沿毛细管壁形成有机双层向负极移动,带负电荷的组分被分配至毛细管近中区域,在电场作用下向正极移动。与此同时,缓冲液的电渗流向负极移动,其作用超过电泳,最终导致带正电荷、中性电荷、负电荷的组份依次通过检测器。

  五、MECC的基本原理

  MECC是在CZE基础上使用表面活性剂来充当胶束相,以胶束增溶作为分配原理,溶质在水相、胶束相中的分配系数不同,在电场作用下,毛细管中溶液的电渗流和胶束的电泳,使胶束和水相有不同的迁移速度,同时待分离物质在水相和胶束相中被多次分配,在电渗流和这种分配过程的双重作用下得以分离。MECC是电泳技术与色谱法的结合,适合同时分离分析中性和带电的样品分子。

  NA 起始材料高重现性的定量结果是成功制备 SureSelectQXT 文库必不可少的条件。安捷伦基因组 DNA ScreenTape 分析法可对基因组 DNA 起始材料实现精确定量分析,并在同一 QC 步骤中对样品完整性进行评估。

  安捷伦高灵敏度 D5000 ScreenTape 分析法是用于 SureSelectQXT WGS 扩增文库的分子量测定和定量分析的理想工具。4200 TapeStation 系统除了具有与 SureSelectQXT 方案推荐的Agilent 2100 生物分析仪系统等效的性能外,还具有高度灵活的样品通量和易用性。


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