流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙浓度

2018年7月13日 13:39:00 来源: 互联网
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流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙浓度

庄明明,温奕欣,刘少列,洪晓鹏  西安交通大学学报2005年10月第26卷第5期

摘要:目的建立流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙离子浓度\[Ca2+\]i的方法。方法 用Fluo3AM作为钙指示剂,在有或无细胞外钙\[Ca2+\]o存在的条件下,测定静息和凝血酶激活状态下人血小板胞浆游离钙离子浓度\[Ca2+\]i的变化。结果Fluo3AM标记的血小板的平均荧光强度明显增加。凝血酶使负载Fluo3AM标记的血小板胞浆\[Ca2+\]i明显增加,且显示剂量依赖和对\[Ca2+\]o的依赖。结论凝血酶引起血小板胞浆\[Ca2+\]i增加的来源主要是\[Ca2+\]o,可能也有部分是内钙释放的参与。

关键词:流式细胞仪;血小板;钙;凝血酶
                     
Determinationofthelevelofcytoplasmicfreecalcium
inhumanplateletswithflowcytometry

ZhuangMingming,WenYixin,LiuShaolie,HongXiaopeng

(DepartmentofClinicalLaboratoryofOverseasChineseHospital,Puning515300,China)

ABSTRACT:ObjectiveTosetupamethodtodeterminecytoplasmicfreecalcium\[Ca2+\]iinhumanplateletswithflowcytometry.MethodsAsacalciumindicator,Fluo3AMwasusedtodeterminethechanges,inducedbythrombin,ofthelevelofplateletplasmafreecalcium\[Ca2+\]iinpresenceorabsenceofoutsidecalcium\[Ca2+\]o,inordertoelucidatewheretheplateletplasmafreecalcium\[Ca2+\]imainlycomefromanditsroleintheactivityofplatelets.ResultsThegeometricmeanoffluorescenceintensityoftheplatelet,labeledwithFluo3AM,wasincreasedobviously.Theconcentrationofplateletplasmafreecalcium\[Ca2+\]iwasincreasedsignificantlybythrombininadoseand\[Ca2+\]odependentmanner.ConclusionTheincreasedlevelofplateletplasmafreecalcium\[Ca2+\]o,inducedbythrombin,mainlycomesfrom\[Ca2+\]oandpartlyfromthereleased\[Ca2+\]oofintraplateletprobably.

KEYWORDS:flowcytometry;platelet;calcium;thrombin

血小板胞浆游离钙离子\[Ca2+\]i与血小板的许多形态与功能活动有关,如血小板形态的改变、聚集、收缩、释放、分泌等。也与血小板参与的凝血、血液流变性调节(如血液黏度、流动性等)以及动脉粥样硬化、脑血管疾病的发生和发展、血管内皮活动等生理、病理过程有关。研究发现\[1\],当血小板内的\[Ca2+\]i达到一定的阈值(400nmol/L)就会发生释放反应以及可逆性聚集。达到另一个阈值(800nmol/L),就会发生不可逆性聚集。因此,研究血小板胞浆游离钙浓度的变化,对阐明血小板参与和调节的许多生理生化以及病理过程有重要意义。人们常用钙荧光指示剂(水母素、Quin2、fura2、Fluro2AM、Fluo3Am)和双波长荧光光度术测定细胞胞浆游离钙浓度\[2-4\]。本文在建立流式细胞术法测定血小板胞浆游离钙浓度的基础上,研究了凝血酶诱导的人血小板胞浆游离钙浓度的变化。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1血液样本       

成人血样,男女兼有,1个月内没有服用阿司匹林及其他影响血小板功能的药物。空腹肘静脉采血,用ACD(ACD∶血=1∶6)抗凝。

1.1.2药品与试剂       

Fluo3AM(溶于DMSO中)、EGTA(溶于超纯度去离子水中)、TritonX100、ADP、凝血酶、小牛血清白蛋白(BSA),均为Sigma(USA)公司产品。ACD(mmol/L:枸橼酸7,枸橼酸三钠85,葡萄糖100)。Hepes缓冲液(mmol/L:NaCl145,KCl5,MgSO41.0,Hepes10,Na2HPO40.5,葡萄糖10,pH7.4)。CaASAHepes缓冲液(在Hepes缓冲液中加入120mmol/LCaCl2和0.94mmol/LASA,pH7.4)。CaHepes缓冲液(在Hepes缓冲液中加入120mmol/LCaCl2,pH7.4)。其他试剂均为市售产品。

1.1.3主要仪器       

FACSCalibur型流式细胞仪,美国BectonDickinson公司产品。

1.2实验方法

1.2.1富血小板血浆(PRP)制备       

抗凝血200×g离心10min,取上清即得富血小板血浆(PRP)。

1.2.2负载Fluo3AM血小板悬液制备       

取PRP,加入乙酰水杨酸(ASA),使终浓度为0.94mmol/L。轻轻摇匀后800×g离心10min,弃上清。取沉淀的血小板,加入CaASAHepes缓冲液1mL,800×g离心10min,弃上清。取沉淀的血小板,加入CaASAHepes缓冲液重悬血小板,调节血小板浓度为2×109/mL。在血小板悬液中加入BSA(终浓度为1.5g/L)和Fluo3AM(4.0μmol/L),轻摇混匀后,在37℃水浴孵育30min后,800×g离心10min,弃上清,用1mLCaHepes缓冲液重复2次,洗去溶液中多余的Fluo3AM。用Hepes缓冲液重悬血小板,调节其浓度为2×106/mL。

1.2.3流式细胞仪测定血小板胞浆\[Ca2+\]i        

取负载Fluo3AM的血小板悬液0.5mL,加入3mL聚乙烯试管中,用CellQuest软件获取和分析数据,激发波长为488nm,测定时,用侧向角(SSC)F1(Fluo3AM)散点图识别血小板,用F1直方图测定平均荧光强度。每个样本获取10000个血小板。用CrykiewiczG\[5\]的等比值法公式计算出血小板胞浆\[Ca2+\]i:\[Ca2+\]i=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)式中Kd是Ca2+结合Fluo3AM的解离常数,为204nmol/L(37℃)。F为各样本荧光强度的测定值。Fmax和Fmin分别是zui大荧光强度和zui小荧光强度的测定值。

zui大荧光强度和zui小荧光强度的测定:在各试管中加入60g/LTritonX100、5mmol/LCaCl2,摇匀,静置10min,用流式细胞仪测定平均荧光强度,此乃zui大荧光强度。用无钙的Hepes缓冲液重悬血小板,调其浓度为2×106/mL,加入25mmol/LEGTA(钙特异性络合剂),摇匀,静置10min,用流式细胞仪测定平均荧光强度,此乃zui小荧光强度。

1.2.4凝血酶对血小板胞浆\[Ca2+\]i的影响       

分别研究缓冲液中有钙和无钙存在时,凝血酶对血小板胞浆游离钙浓度的影响。在CaASAHepes缓冲液和无钙的Hepes缓冲液中加入凝血酶10、100、1000U/L,用此缓冲液制备负载Fluo3AM的血小板悬液,用流式细胞仪测定10000个血小板的平均荧光强度。为了观察血小板\[Ca2+\]i随时间的变化,分别在加入凝血酶后5、10、15min时各测定一次。
〖2〗西安交通大学学报(医学版)〖3〗第26卷5期〖2〗庄明明,温奕欣,刘少列,等.流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙浓度1.3       统计学方法       所用数据用±s表示,用SPSS10.0version软件和tstudenttest法统计分析实验结果。

2结果

2.1人血小板胞浆\[Ca2+\]i       

将样本放置在样本架上,按下"run"按钮,开始获取数据,以未标记荧光素的样本为空白对照,并用它调整阴性区域的位置,然后依次测定各个样本。结果见图1。

2.2在外钙\[Ca2+\]o存在时凝血酶刺激对人血小板\[Ca2+\]i的影响       

在1mmol/L\[Ca2+\]o存在时,血小板静息\[Ca2+\]i为(108.9±10.5)nmol/L(n=8),在加入10、100、1000U/L凝血酶后,血小板\[Ca2+\]i明显上升,而且有明显的剂量依赖关系(表1)。100U/L凝血酶可以使\[Ca2+\]i增加6.4倍。5min时,血小板\[Ca2+\]i水平较开始加入凝血酶时降低,10min时接近于静息水平。

2.3无外钙\[Ca2+\]o存在时人血小板\[Ca2+\]i对凝血酶刺激的反应       

在缓冲液中没有钙存在的情况下,血小板的\[Ca2+\]i为(29.5±5.6)nmol/L(n=8),缓冲液中凝血酶的水平为10、100、1000U/L时,血小板\[Ca2+\]i的水平有所上升,但上升的程度明显小于有外钙时。100U/L凝血酶使血小板\[Ca2+\]i增加1.3~1.5倍,并在5min时恢复到静息水平(表1)。表1有或无\[Ca2+\]o时凝血酶对血小板\[Ca2+\]i的影响(略)
    
3讨论

本实验使用的Fluo3AM为细胞可通透的细胞内钙荧光指示剂,在没有水解前和(或)无Ca2+存在时,不显示荧光,低亲和性结合测量到的瞬间Ca2+峰值比Fura2的高\[6\]。TritonX100能增加细胞膜通透性,提高胞浆内Ca2+的浓度,因此,用它测定胞浆内Ca2+饱和浓度。EGTA\[Ethylenelycolbis(2aminoethylether)-N,N,N′,N′tetraaceticacid\]是镁存在时测定钙浓度的鳌合剂\[7\],也是有效的金属蛋白酶的抑制剂\[8\],在测定zui小荧光强度时,用EGTA络合胞浆内的Ca2+,使胞外的Ca2+浓度zui低。ASA(乙酰水杨酸)是血小板稳定剂,可以防止血小板聚集,并保证血小板的功能完善。

血小板静息\[Ca2+\]i是指没有任何刺激存在时,血小板胞浆的游离钙浓度。实验结果显示,\[Ca2+\]o为1mmol/L时,人血小板的静息\[Ca2+\]i为(108.9±10.5)nmol/L;\[Ca2+\]o为0mmol/L时,其静息\[Ca2+\]i为(29.5±2.6)nmol/L。在血小板缓冲液中加入凝血酶后,血小板\[Ca2+\]i迅速上升,而且有明显的剂量依赖关系。\[Ca2+\]o为1mmol/L时,0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板内游离钙浓度分别上升1.58、6.42和10.05倍。另外,\[Ca2+\]o为0mmol/L时,凝血酶也使\[Ca2+\]i有所提高,但提高的幅度明显减少,如0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板内游离钙浓度分别上升0.13、1.3和2.5倍。结果说明,血小板\[Ca2+\]i的高低与\[Ca2+\]o存在与否有密切关系。而且在凝血酶的刺激存在时,\[Ca2+\]i提高的程度也与\[Ca2+\]o有密切关系。提示血小板内钙的升高主要依赖于\[Ca2+\]o的存在,但不排除内钙释放的参与\[9,10\]。

流式细胞术在生物医学和分子生物学研究领域的广泛应用,大大推进了相关学科的发展。结合荧光探针技术,对细胞表面抗原、荧光蛋白表达、DNA含量及其细胞周期、细胞凋亡等进行大量、多参数检测与分析,是流式细胞术的特点。我们应用Fluo3AM和流式细胞术测定血小板\[Ca2+\]i,因为Fluo3AM很容易进入细胞,荧光强度高,操作方法简单易行,测量灵敏度高,重复性好,是研究细胞内\[Ca2+\]i的有效方法。

参考文献

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作者简介:庄明明(1941),男,广东普宁人,副主任检验师.               

(广东省普宁市华侨医院检验科,广东普宁515300)


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