3.1 叶和根组织的收集和沉淀蛋白
( 1 ) 从植物的中部切取绿色叶片，迅速放入塑料袋里冷却。如果没有冰箱，可先放到冰上，再放入 -20°C 保存。
( 2 ) 对于根部组织，从茎部下面切一寸的根，摇晃根部并迅速放入水中洗掉泥土，连续洗 3 次，然后再迅速放入塑料袋里速冻或放在冰上暂时保存。
( 3 ) 称取 2.5 g 速冻的根及叶组织，除去多余的茎及其他杂质，用预冷的剪刀将 这些组织剪成小碎片，放入预冷的研钵中，在液氮中磨碎。
( 4 ) 将这些研碎的根叶组织放入 40 ml 离心管中，用 25 ml 悬浮缓冲液悬浮这些粉末，用力摇晃混合，放 -20°C 保存 45 min，再摇，35000 g 离心 15 min。
( 5 ) 除去上清液，不搅动沉淀，用相同体积的 EDTA 水溶液洗沉淀（见注释 1) ，放冰上 3~4 min。35000 g 离心 15 min，至少再洗两次，直到沉淀不再是绿色。
( 6 ) 沉淀冷冻干燥，直到变成灰褐色。它含有蛋白以及细胞壁和纤维等其他物质。
3.2 从 TCA/丙酮粉末中制备蛋白样本
( 1 ) 称取 15 mg 的 TCA/丙酮粉末（15. 3.1 中制备好的沉淀），放入 1.5 ml 的离心管。
( 2 ) 向每一个离心管中加 1 ml 的 100 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.5 ) ，祸旋 1 min，18000 g 离心 10 min，去掉上清液（见注释 2) 。
( 3 ) 向每个离心管中加 1 ml 的硫脲缓冲液，从粉末中萃取蛋白质，涡旋 5 min，超声 10 min。然后在摇床中摇 30 min。
( 4 ) 18000 g 离心 10 min，取上清液。上清液中含有从叶组织中抽取的蛋白质， 浓度为 0.5~1 μg/μl。
3.3 制备 CyDyes 染料及蛋白荧光标记
( 1 ) 用新鲜的 DMF 制备 CyDyes ( 见注释 3 ) ，因 DMF 容易氧化降解， 所以制备 CyDyes 染料时要用新鲜的 DMF。
( 2 ) 制备 CyDyes 溶液，每 1 μl CyDyes 染料中加入 1.5 μl DMF。1 ml CyDyes 溶液用来标记 50 μg 的蛋白质（见注释 4) 。由于 CyDyes 对光敏感，故需用锡箔纸包住离心管，放在黑暗中保存。
( 3 ) 每个样品吸 100 μl ( 含有 50 μg 的蛋白质）放入 0.6 ml 的离心管中（见注释 5 )，这时候样品还是分开的， 一 个样品中放入 1 μl Cy3 工作液， 另外一个样品中放入 1 μl Cy5 工作液（见注释 6)。
( 4 ) 涡旋 10s，短暂离心，重复两次。
( 5 ) 在冰上放置 30 min，避免光照。
( 6 ) 每个样品中加入 1 μl 10 mmol/L 赖氨酸来终止反应，然后在冰上放置 10 min。
( 7 ) 每 100 μl 荧光标记的样品加入 250 μl IPG 缓冲液，终体积为 450 μl ( 见注释 7 ) 。
3.4 第一向蛋白质分离：等电聚焦
( 1 ) 将 Bio-Rad 聚焦托盘放入 Bio-Rad 的聚焦室内。吸取样品放入中间的托盘内，避免气泡产生。
( 2 ) 用镊子去掉 IPG 干胶条的塑料皮，放入托盘里，确保阳极连着托盘的阳极 ，阴极对着阴极，仔细抬高胶条的一端，放下胶条的另外一端，确保整个胶条都能被缓冲液浸泡，还要确保没有气泡产生。
( 3 ) 用矿物油覆盖胶条，防止通电时胶条变干。
( 4 ) 通常完全聚焦需要最少 67000 Vh。
a. 推荐程序：水化 50 V 12 h，500 V 1 h，1000 V 1 h，8000 V 9 h，100 V 5 h。
b. 第一步为水化，不能少于 12 h，由于 Cy 染料对光敏感，所以聚焦托盘应该覆盖避免光照，或者整个仪器放在黑暗房间中使用。
c. 最后一步是移除窗口，胶条在这期间能够取出。低电压确保胶条能够完全聚焦，直到从托盘中取出。
3.5 SDS-PAGE 二向凝胶的准备
( 1 ) 低荧光玻璃板减少背景的干扰。
a. 为了扫描时易于操作，玻璃板凝胶接触的一面要涂抹亲和硅烷。为了凝胶好剥离 下来，凝胶接触的另一面要涂抹剥离硅烷。
b. 用 Milli-Q 超纯水和纸巾擦拭低荧光玻璃板不接触胶的那面，用乙醇和纸巾再擦拭一遍。
c. 每次加 0.5 ml 亲和硅烷工作液到不接触胶的那面，用纸巾使之均匀分散，直到每块板总的工作液有 1 ml。
( 2 ) 先用乙醇擦拭玻璃板，接着用水擦，逐渐加入 0.5 ml 剥离硅烷直到每块玻璃板都抹上了 1 ml 的剥离硅烷，干燥 5~10 min，除去多余液体。
( 3 ) 将玻璃板放在干净的地方干燥至少 3 h，注意亲和硅烷和剥离硅烷处理的玻璃板要分开放置。在灌胶前用氮气吹走玻璃板上的灰尘。
( 4 ) 将纸质圆点标记放于用亲和硅烷处理过的那面。每一个标记应当放在离板边缘约 1.5 cm 的短边的中点。根据编号系统，标记也应当放置在板边缘约 1.5 cm 处的底部。这样可以在随后的每一个处理步骤中区分不同的凝胶。
( 5 ) 12.5% 凝胶的制备（总共 900 ml，可以灌 12 块胶）：281 ml 40% 丙烯酰胺储液，225 ml 1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8，376 ml Milli-Q H2O，9 ml 10% SDS，9 ml 10% 过硫酸铵，125 μl TEMED。先将丙烯酰胺、Tris-HCl、Milli-Q H2O 和 SDS 放入大烧杯中彻底混合，再过滤这种混合物（0.2 μmol/L ) ，然后放入一个贮存器中，贮存器通过一个蠕动泵和灌胶室连接。
( 6 ) 打幵搅拌器，迅速加入过硫酸铵和 TEMED ( 15s 内），打开蠕动泵。
a. 当几乎所有的混合液被泵入时，打开混合器侧面让尽可能多的混合液泵入。
b. 在空气进入管道前，加入置换液到软管室。
c. 继续缓慢灌胶，直到 12.5% 的溶液刚好低于不接触胶板的顶部。
( 7 ) 关上泵，加入水饱和的丁醇以确保覆盖住胶的顶部和下部（丁醇在分隔液的上部），放置 1 h，然后倒掉丁醇，覆盖 Milli-Q H2O。
( 8 ) 胶最好是在室温放置过夜，当彻底凝固时再用。拆除灌胶仪器，洗掉玻璃板上的丙烯酰胺。立刻用胶或者放冰箱暂存（最多可以保存一个星期）。
3.6 二向蛋白质分离：SDS-PAGE
( 1 ) 从托盘中取出等电聚焦胶条，用 Kimwipe 轻轻擦拭胶条的前后端以除去过多的矿物油，小心不要将 Kimwipe 触到胶条，如果需要干胶条可以保存在 -80°C 冰箱中。
( 2 ) 将胶条放在平衡托盘中，一端稍高放置。
a. 在摇床上，用 2 ml 新鲜的还原再平衡缓冲液洗胶条 30 min。
b. 弃还原再平衡缓冲液，加 2 ml 新鲜的烷基化再平衡缓冲液。
c. 摇床摇 30 min，弃烷基化平衡缓冲液。
d. 加 2 mL SDS 电泳缓冲液，摇床摇 5 min。
( 3 ) 仔细将胶条放入预先制备好的 24 cm 的凝胶上（见 15.3.5 节） ，将胶条的塑料一端靠在玻璃板的一端，这样使胶条容易、方便放置在凝胶上，胶条和凝胶之间不能有气泡，用 0.5% ( m/V ) 的琼脂糖密封液密封胶条，吸取密封液，放置在胶条上部，室温凝固。
( 4 ) 将凝胶的胶板放入与循环的冷水系统相连的 Ettan DALTsix 电泳室里。
a. 将胶放在小槽的外部，当同时跑几块胶时，将它们均匀地放在两边，面向同一个方向。
b. 将空胶板放在池子里，直到每个槽都放满。
c. 灌入电泳缓冲液，直到到达最大刻度线的底部。
d. 将盖子与底部电源接通，开始电泳。
e. 如果是过夜电泳，设置电量为 2 W/gel。如果只在白天电泳，可以提高电压，但不要超过 8 W/gel。
3.7 荧光图像扫描
( 1 ) 打开 Typhoon 扫描仪，在使用前先预热 30 min，预热是为了扫描更精确。
( 2 ) 在使用前后都必须用乙醇和擦拭纸将玻璃板擦干净。不要用纸巾擦拭，因为容易刮伤玻璃面。
( 3 ) 将玻璃板从胶槽中取出，表面擦干净，将玻璃 cassettes 中的荧光标记凝胶按正确的方向放在玻璃板上。
( 4 ) 用合适的滤波和波长来扫描图像，每种标记物的波长如下：Cy3 用 580BP 的滤波，532 nm 的绿色激发光；Cy5 用 670BP 的滤波，633 nm 的红色激发光；Cy2 用 520BP 的滤波，488 nm 的蓝色激发光。初始参数为 depth+ 3 mm，600 V 光电倍增管设置和 500 μm 的像素，反复进行 50~100 μm 的像素高分辨率扫描。
( 5 ) 用 Typhoon 扫描仪软件可以获得图像，用数据集格式保存在包含 gel 图像的相关文件夹中，这样可以用 ImageQuant 打开，然后可以用数据集格式再保存，用来在 DeCyder 作进一步的处理。或者 Tiff 格式，可以使用其他图像分析包来做进一步的处理，如 Progenesis ( Nonlinear Dynamics) 。
3.8 图像分析
通过不同波长所获得的图片用 DeCyder 进行比较分析（见注释 8) ，由于程序复杂 ，在此不作详细介绍，基本步骤如下所述。
( 1 ) 为了确保图像大小完全匹配，用 Process Image 测量而且进行标准化，产生一个柱状图，显示两张图片中没有产生变化的、增加的、减少的蛋白质点数量。
( 2 ) 使用排除过滤法，或手动删除任何明显的非蛋白质背景斑点或条纹。按照需要，调整柱状图的临界参数显示蛋白质点。这些蛋白质点是指定量的上调或下调表达，如大于 2 倍的差异。
( 3 ) 手动检查柱状图和图像，以确定哪些点有明显表达变化，而且有足够的量用于质谱鉴定。在大多数情况下，许多蛋白质尽管有显著差异表达，但由于量很少以致于无法进行可靠的定量和可行的鉴定。最值得研究的蛋白质点通常具有中、高丰度而且差异表达非常明显。
( 4 ) 为了更精确地定量差异表达，特别是差异性非常微弱的情况下，整个程序需要重复 3 次，这样结果才有统计学意义（见注释 8) 。
3.9 为了进一步处理进行再染
接下来是进行图像分析。取走玻璃盒里的隔条，胶进行银染 [ 29，30]。银染要在固定的玻璃板上进行，这样可方便观察，并且可以手工挖取蛋白质点，以进行下一 步的质谱鉴定 [6]。相对于 CyDye 标记只能标记少部分蛋白质而言 [8] ，银染能保证绝大多数的蛋白质都能标记上。通过银染，用 CyDye 标记的大部分蛋白都能看见，尽管在不同的样品之间还是有一些变化。比对银染的图像和 CyDye 图像，小心确保挖到正确的点。一些小分子质量的 CyDye 通常会引起一些漂移，一些蛋白用不同方法也会引起一些差异（见注释 9)。
3.10 结果分析：番茄根部响应盐胁迫的蛋白质表达差异测定
1. 盐胁迫处理
( 1 ) 在控温温室里，让番茄长到 4 英寸（1 英寸= 25. 4 mm) 高。
( 2 ) 在试种时，将 20 棵幼苗在包含 MiracleGro 肥料的 Hoglan 混合肥料中生长。
( 3 ) 所有 20 棵植株每天正常浇水。20 天后，对其中的 10 株进行标记，用 25 mmol/L NaCl 处理一个星期。在此后的一个月时间里，逐渐将 NaCl 浓度提高到 100 mmol/L。
( 4 ) 10 株对照植物在整个期间都用水浇灌。
2. 叶和根组织的收集
( 1 ) 在 7 个星期期间，在连续浇灌了两个星期的 100 mmol/L 氯化钠之后，剪下 3~5 g 对照及处理的健康植株叶片，一个星期两次，直到叶片坏死。
( 2 ) —旦叶片坏死，植株连根拔起，用水冲洗根部，从根的中部分成近茎端和远茎端两部分，立刻液氮中进行速冻。
3. 近茎端蛋白质的抽提
( 1 ) 用研锤将收集到近茎端根研碎。
( 2 ) 按 15.3.1 节提到的 TCA 丙酮方法制备蛋白质沉淀物。
( 3 ) 由于凝胶上显示根所含的蛋白质比叶少，有必要按 15. 3. 2 节的方法抽提 3 次蛋白质，将这 3 次抽提的蛋白质放入到一个离心管中，进行 CyDye 标记 。
( 4 ) 汇集样品，跑胶用 15. 3. 3 节、15. 3. 6 节的方法分析，结果见图 15 -1 ~ 图 15-4。
4. 对照及盐胁迫的近根组织部分 DIGE 凝胶的图像比较分析
来源于 4.3 的数据用 DIA 模型进行分析，这种模型在 15.3.8 节中已有介绍。从 DeCyder 程序输出的起始数据用虚拟颜色代表，如图 15-1 所示。Cy 5 标记的对照植株蛋白点为红色，Cy3 标记的盐胁迫植株的蛋白质点为绿色，两种植株都有且表达量相似的蛋白点为黄色。这样对于那些表达差异明显的蛋白质易于识别。在这个实验示例中，绝大多数的蛋白质点为黄色，说明这两个样品中蛋白表达差异不是很明显。
两种荧光波长扫描的不同图像如图 15-2 所示，这些图像可以用来进一步分析蛋白质表达差异。这两张图像看起来很相似，但是图 15-2B 上的蛋白点更多。总体蛋白质载入或者是标记效率有明显的区别，这也是这种方法的一个显著优点。软件可用于标准化这两张图像的表达量，所有的蛋白点包含在内，只有那些表达量高于或低于平均值的蛋白质点被标示为差异蛋白点。
两个图像的定量分析产生的柱状图如图 15-3 所示。正如蛋白质点检测窗口所示，在标准化和处理后，软件检测到 421 个蛋白质点，其中有 384 个没有变化的蛋白点， 34 个 Cy3 标记的表达量升高的蛋白点，3 个 Cy5 标记的表达量升髙的蛋白点。x 轴为这两个图片的蛋白质点的体积的 log 值的比率，左边的 y 轴为蛋白质点的频率，右边的 y 轴为代表每个蛋白点的绝对突光强度，也就是蛋白质量。蓝色曲线表示蛋白质点频率模式柱状图，是基于红色曲线的实际柱状图生成的。
两条垂直的线表示蛋白质表达差异达 1.5 倍的 x 轴点和表达没有变化的蛋白质点，颜色使用策略和图 15-1 相似，黄色代表没有变化的蛋白点，绿色代表 Cy3 标记表达量升高的蛋白点，红色代表 Cy5 标记表达量升高的蛋白点。
在这种类型的分析中，许多蛋白点检测到表达量上有变化，但是这种变化是很微弱的以至于不易鉴定。在图 15-3 的分析中，我们运用了一个绝对荧光阈值即 106 荧光单元（如虚线所示）来排除这些蛋白质点。这里有 4 个蛋白质点，标记为 a~d，x 轴上在正常分布曲线之外，y 轴上超出了 106 荧光单元，因此这些蛋白点为 Cy3 标记的表达量超过 1.5 倍的蛋白点，这种表达量可以用来进行质谱鉴定。在柱状图里还有很多蛋白质表达差异显著，但是低于我们指定的阈值。
这 4 个强调的蛋白质代表那些响应盐胁迫并且上调表达量超过 1.5 倍的蛋白质。前 3 个蛋白点即标记为 a 、b 和 c 的蛋白点突显了这种方法的缺点，它们是一个低分辨率蛋白质的一部分，这个蛋白质已经用分析软件人工划分为几个蛋白点。然而标记为 d 的蛋白点是一个髙分辨率的蛋白点，荧光体积率为 1.79， 如图 15-4 所示，这个蛋白点可以切下来进行质谱鉴定。 展开 | 
