比较详细的PCR 技术
实验概要
一种比较详细的PCR技术
实验原理
1. TaqDNA聚合酶
在早期进行的PCR反应中，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶1的大片段，即Klenow片段。也曾有人用噬菌体T4
DNA聚合酶。这两种酶的共同弱点是对热不稳定性，DNA合成反应只能在37°C进行。PCR时每一循环的解链温度都在90°C以上进行，故在每两个循环之间要加入新的DNA聚合酶，使得整过程整个实验过程很繁琐和昂贵。同时在37°C，引物与DNA模板之间会发生分子非特异性结合，最终导致很多非特异性DNA片段的扩增。
Taq 酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是72°C（75-80），连续保温30分钟仍具有相当的活性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR操作过程自动化的实现。
相对分子质量为94000的TaqDNA聚合酶的酶活性较高，大约为200000Umg，在合成时有一个较高的最适温度75-80°C，转换数KCat接近150nt/(s•酶分子)。这种活性有明显的温度依赖性。TaqDNA聚合酶虽然在90°C以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定。有人试验证明在92.5°C，95°C，和97.5°C时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95°C（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。
TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80°C时，dNTP的掺入速度为35-100nt/(•；酶分子)，最长延伸长度7.6kb，如对M13上的富含G°C的30-me引物，该酶在70°C的延伸率高于60nt/(•酶分子)，在55°C仍有较高的延伸活性，22°C和37°C时延伸速度分别为0.25和1.5
nt/(•酶分子)。由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90°C以上）时，很少DNA合成。在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。温度对TaqDNA聚合酶活性的影响见表。
由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80°C，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。
2. 模板
（1）模板的纯度一般不要求很高，不需要达到超纯。某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂（如EDTA）等，会与Mg2
络合，影响Taq DNA聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。
（2）模板DNA的量一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。有时，加的模板太多，会令扩增失败。这时如果对模板稀释后再加入反应体系中，往往能获得成功。
3. dNTP
dNTP储备液必须为PH7.0左右，浓度一般为2mmol/L，分装后置-20°C保存。典型的PCR扩增体系中，两种dNTP的终浓度为20-200umol/L。理论上，100ul反应液中两种dNTP的浓度为20umol/L时，足以合成12.5ug
DNA或合成10pmol 400bp的DNA片段. DNTP会络合溶液中的 Mg2，而且大于200umol/L的dNTP会增加Taq DNA聚合酶的错配率.如果dNTP的浓度达到1mmol/L时，则会抑制Taq DNA聚合酶活性.
4. Mg2 浓度
Taq DNA聚合酶在合成新DNA链时，要求有游离的Mg2，因而在PCR系统中确定Mg2的最适浓度是必要的。Mg2浓度太低会无PCR产物，太高又会导致非特异的产物产生。故常需根据各自的实验预先试验，以确定本实验的最佳Mg2浓度，保证DNA聚合酶具有良好的活性。
通常情况下，要求反应体系中有0.5-2.5mmol/L的游离Mg2。反应内容物中，dNTP能与Mg2。结合，所含EDTA会与Mg2络合，高浓度的DNA也有干扰作用，都会影响Mg2的有效浓度。
5. PCR系统中的其它成分
PCR反应缓冲溶液通常用10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3， 20°C)，它是两性离子缓冲剂.此外，还有50 mmol/L
KCL，它有利于引物与模板退火.高于50mmol/L 的KCL，或50mmol/L 的NaCl对Taq
DNA聚合酶有抵制作用.明胶或血清白蛋白(100ug/ml)及非离子去污剂，如Tween20等，对Taq DNA聚合酶起稳定作用.
6. PCR的热循环计划
在标准反应中，将标本加热至90-95°C，使DNA双链变性，再快速冷却至40-60°C使引物退火并结合到互补靶序列上，然后升温至70-75°C，在Taq
DNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸使引物沿模板延伸.每步时间从反应达到要求温度后计算.
PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性\引物退火和反应延伸3个步骤组成的.图中设定的反应参数是94°C变性1分钟，60°C退火1分钟，72°C延伸1.5分钟.如此周而复始，重复进行，直到扩增产物的数量满足实验需求为止.
(1)
变性温度与时间使靶基因模板和PCR产物完全变性是PCR成败的关键.DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟，但反应管内达到Tss还需一定时间，变性温度太高会影响酶活性;通常情况下94-95°C变性1分钟就足以使模板DNA完全变性，更高的温度可能更为有效(尤其是富含C
G的靶基因)，若低于94°C，则需延长变性时间.为提高起始模板的变性效果，保存酶活性，常常在加入Taq
酶之前97°C先变性7-10分钟，再按94°C的变性温度进入循环方式，这对PCR的成功有益处.
(2)
复性温度与时间复性温度决定着PCR的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在PCR条件下真实Tm值的5°C，引物越短（12-15bp），复性温度越低（40-45°C）。一般来说，若降低复性温度（37°C），可提高坟增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高复性温度（56-70°C），虽扩增反应的特异性增加，但扩增效果下降。理想的方法是：设置一系列对照反应，以确定扩增反应的最适复性温度。
(3)延伸温度与时间
Taq
DNA聚合酶虽能在较宽的温度范围内催化DNA的合成，但不合适的温度仍可对扩增产物的特异性、产量造成影响。引物延伸温度一般为72°C（较复性温度高10°C左右），延伸时间视目标DNA片段长短和浓度而定。在最适温度下，核苷酸的掺入率为35-100nt/s，这也取决于缓冲体系、PH值、盐浓度和DNA模板的性质等，延伸1分钟对长达2kb的扩增片段是足够的，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现，但在循环的最后一步延伸时，为使反应完全，提高产量，可将延伸时间延长4-10分钟。
（4）循环数循环数决定着扩增程度，常规PCR一般为25-40周期，在其他参数交已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度，其相应关系参照下表
模板DNA分子数需要热循环次数
3．0×105 25-30
1．5×104 30-35
1．0×103 35-40
循环次数太少，得不到一定的产物量；循环次数太多时，扩增反应的后期，产物积累的指数率下降甚至不再有正确的产物生成，正常的反应几乎停止，呈现平台效应。
影响出现平台效应的因素有：
A 反应试剂（dNTP或酶）稳定性的改变；
B 终产物（如焦磷酸）的抑制效应；
C 产物浓度超过10-5时可产生重复退火，于是会降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性
D 高浓度产物DNA双链的解链不宝剑。平台效应时的一种重要后果是由于错误引导，在开始时浓度不高的非特异产物会继续扩增，使结果的分析复杂化。
7. 引物的要求：
（1）一般长15-30bp，常用20bp（理论上420=11×1011长的DNA片段才会有重复）。引物过长，扩增的效率降低。
（2）碱基组成：C G占50-60%（常规），尽量避免数个嘌呤和嘧啶的连续排列。
（3）一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是3‘末端；引物之间的碱基互补会形成引物二聚体，引物本身应避免回文序列。
（4）引物与模板退火的温度和所需的时间取决于引物的碱基组成、长度和溶液中引物的浓度。合适的退火温度是低于引物本身的实际变性温度（Tm）50°C。20bp左右长度的DNA片段的Tm=(G
C) ×40°C (A T)
×20°C。退火火温度通常在55-72°C下进行在标准的引物浓度（0.2umol/L）下，几秒内即可完成退火。提高退火温度可提高引物与模板结合的特异性。特别在最初几次循环中采用严谨的退火温度，有助于PCR特异性扩增。如果引物中（G
C）的含量小于50%，退火温度应低于55°C。
（5） 100ul的PCR反应液中，引物的绝对量为10-100pmol。PCR反应液中2个引物浓度不等时，其浓度比为50:1，称为不对称PCR。
简并引物：由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。若PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氨基酸顺序推测而来，就需合成简并引物。
嵌套引物：利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料，同时除使用第一轮的一对特异引物外，另加1-2个新引物（处在同一个模板DNA的头两个引物之间序列）进行第二轮扩增。通过嵌套引物扩增的产物，产生错误扩增的可能性极小，所以应用嵌套引物技术能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增。
PCR的的应用：基因克隆、反向PCR、不对称PCR、RT-PCR、基因的体外诱变和突变检测、基因组的比较研究。
主要试剂
1. 引物：根据待扩增DNA不同，引物亦不同。
2. TaqDNA聚合酶：能耐受93-100°C的高温。
3. 10*PCR缓冲液：含500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-HCl(pH8.4, 20C)、150mmol/L MgCl及1mg/ml明胶。
4. 5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP、dTTP钠盐各100mg合并，加3ml灭菌无离子水溶解，用NaOH调pH值至中性，分装每份300ul，-20C保存。DNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。
5. 标本处理试剂：
实验步骤
1. 向一微量离心管中集资加入如下物质：
10×PCR缓冲液 1/10体积 DNA模板 10-10拷贝
dNTP 各200umol/L ddHO补至终体积（终体积50-100ul）引物（一对人工合成寡核苷酸）各1umol/L
混匀后，离心15秒使反应成分集于管底。
2. 加石蜡50-100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97°C变性7分钟（染色体DNA）或5分钟（质粒DNA）。
3. 冷至延伸温度时，加入1-5uTaqDNA聚合酶，在此温度下作用1分钟。
4. 于变性温度下（92-93°C）使模板DNA变性45秒。
5. 在复性温度下（55°C）使引物与模板杂交45秒。
6. 在延伸温度下（72°C）使复性的引物延伸1分钟。
7. 重复4-6步25-30次，每次即为一个PCR循环。
8. 微量琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。
PCR的结果分析
1. 琼脂糖凝胶电泳
2. 限制性内切酶片段分析 用限制性内切酶酶解PCR产物，发现有特定的限制性内切酶片段，则说明扩增的PCR产物是特异的，反之表明PCR产物在限制性位点发生了碱基突变。
3. 核酸杂交 首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。阳性表明PCR产物是特异的。
