光纤式在体荧光显微成像系统在动态观测活体动物脑内...
光纤式在体荧光显微成像系统在动态观测活体动物脑内神经元中的应用
中国上海复旦大学脑科学研究院、医学神经生物学国家重点实验室的石 莹，陈露岚，姜 民等人在生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): 695–699 发表文章对建立大鼠脑内神经元的在体显微荧光连续观察的实验方法进行研究。研究开始将含有绿色荧光蛋白的重组病毒载体(Ubi-GFP)微注射到Sprague Dawley (SD)大鼠大脑皮层区，7天后用微创手术将光纤探头植入动物脑内目标位置，使用在体荧光显微成像技术观察到微注射区GFP标记神经元的特异性荧光信号。随后对大鼠脑组织行冰冻切片，荧光显微镜对切片的观察结果验证了在体荧光显微成像实验中观察到的荧光信号。该方法既保证了在体实验中动物处于生理状态，又满足了体内神经组织荧光显微水平成像的要求，可以用于动物脑内神经元荧光信号的在体追踪记录，为在体神经科学实验提供了有效的技术保障。
应用在体荧光显微成像技术观察大鼠脑内神经元
将大鼠用7% 水合氯醛(0.6 mL/100 g) 经腹腔注射麻醉，剃毛并固定于立体定位仪上。暴露前期的颅骨孔道，打开在体式荧光显微成像记录系统，将在体式荧光显微镜直径为650 μm 的柔软光纤ProFlex 垂直插入大鼠脑内，穿过脑膜，垂直进针1.8mm 达PtA 区的微注射部位，通过488 nm 的激光器激发，采集信号波段为500~650 nm，采集频率为12 幅/s 记录在体荧光影像( 图1)。
2 结果
2.1 大鼠脑内神经元在体荧光显微成像
通过在体荧光成像系统可以实时采集到光纤探头所在目标位置的荧光影像。在大鼠脑内的微注射部位，微调光纤探头，选择两个视野进行观察并各记录10 min 内GFP 标记神经元的荧光信号的动态变化。使用IC-Viewer 软件，可将记录到的数据以影像或图片格式导出。图2A 和B 显示的是从同一样本采集的两段数据中分别导出的时长为10 s 的6张连续截图，在图中可观察到相应时间点处多个被GFP 标记的脑内神经元的形态，神经元胞体的GFP荧光信号较明显。在记录的时间段内，GFP 标记的神经元形态未见明显变化。
探头式在体荧光显微成像技术是通过对微细光纤探头和激光扫描两个技术的组合[8]，从而实现实时追踪记录动物体内信号动态变化过程的功能。而且，由于探头的直径仅650 μm 且材质较柔软，可满足动物微创手术的要求。探头是由近3 万根柔软的光纤组成的( 图4)，其观测范围达600 μm × 500μm， 轴向分辨率为15 μm，横向分辨率为5 μm，敏感性较高，因此可以在神经科学领域内用于动物脑内神经元信号的在体追踪记录[9]。在体荧光显微成像技术通过488 nm 的激光器激发，采集信号波段500~650 nm，采集频率为12 幅/s 记录在体荧光影像。该仪器设备所采集的信号编码是13 bits，通过软件可以导出png、bmp、jpeg 等多种格式的图片以及mpeg、mhd (raw format) 等格式的影像。通过在体荧光显微成像技术，实时地观察到大鼠脑内GFP 标记的神经元的形态。10 s 内的连续截图显示，虽然活体动物的呼吸、血管跳动等生理因素对影像的稳定性会产生细微的影响，但目标神经元的短时间内截取图像仍相对比较稳定，神经元胞体荧光信号比较清晰，且与文献报道非常相符[5]。这也提示在记录过程中未产生明显的光毒性。将同一大鼠的脑组织进行冰冻切片，在荧光显微镜下进行观察，观察到了GFP 标记的神经元，也进一步证实了在体荧光显微成像技术的客观有效。
结果表明，探头式在体荧光显微镜可以稳定地记录一段时间内特定视野的神经元形态，因此可以与立体定位技术结合，用于神经元发育、神经元迁徙等研究的观察手段。探头式在体荧光成像技术因其实时采集图像信的功能特点，结合图像分析软件，除了可以进行在体神经元的形态学实时观察，还可以对体内的快反应现象如钙离子流变化等进行动态数据采集[5]，也可以对神经元以外的组织结构如血管指标等进行分析，甚至与在体的其它生理信息进行同步采集。配套使用相应的切口固定配件，可以完成动物清醒状态下的数据记录。
另外，鉴于光纤式探头的激发波长为488 nm，在光遗传学研究中，也可用于精准定位激活ChR2 光敏蛋白。
综上所述，光纤式在体荧光显微成像技术为我们神经科学实验提供了更大的拓展空间。
本文节选自复旦大学脑科学研究院、医学神经生物学国家重点实验室的石 莹，陈露岚，姜 民等人在生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): 695–699 发表文章
