基因敲除小鼠在药物依赖性研究中的应用（一）
基因敲除(gene knockout ) 是 80年代初出现的一项新的基因工程技术, 是制备转基因动物的重要技术之一。利用该技术可以培育先天缺陷某一特定基因的动物, 以此研究该特定基因的生理功能或在疾病发生发展中的意义。近年来基因敲除小鼠在药物依赖性研究中也得到广泛的应用。在传统的药物依赖性研究中, 往往选取特异性的受体配体来研究该受体在依赖性中的作用, 但这种特异性往往是相对的 ,剂量改变就可能影响其它受体的功能,所以难以真正确定该受体的作用。而基因敲除技术在这方面具有独特的优点, 因为利用基因敲除技术可以选择性敲除某一特定受体基因, 获得先天缺陷该受体基因的小鼠,通过比较基因缺失动物(本文简称 KO型) 和野生型动物(本文简称 WT 型) 在依赖性模型上的行为差别 , 可以准确判断该受体所发挥的作用。可以说, 基因敲除技术的发展为药物依赖性研究带来了一场新的革命。本文综述了近年来这一方面的研究进展。
1 基因敲除技术简介[1 ]
基因敲除是通过人为干预达到抑制或灭活目的基因表达的分子生物学技术。它采用同源重组方法(homologous recombinat ion)用突变的基因删除(取代)相应的正常基因, 或用正常基因敲除相应的突变基因, 从表达水平或转基因动物的表现型来研究正常基因的功能和突变部位的作用。利用基因打靶 (gene target ing) 技术获得基因敲除动物是其中的一种方法, 其步骤是使胚胎干细胞内的目的基因进行定点突变 (基因打靶) , 将打靶后已定点突变的胚胎干细胞注射到宿主胚泡中, 再将胚胎植入假孕母体的子宫内,使其发育成目的基因缺陷 (突变) 的杂合的种系嵌合体, 将其自交后再筛选出目的基因缺陷型的纯合子即基因敲除动物。通过分析基因敲除动物体内单基因缺陷所产生的表型异常来研究基因调控和功能, 建立疾病的动物模型以及进行基因治疗等。
2 敲除阿片受体基因
阿片受体是阿片类物质直接作用的受体, 不仅在介导阿片类镇痛中发挥重要作用, 而且也与精神活药物物的依赖性有关。阿片受体分为μ、δ和κ等几种亚型,目前 ,已经培育了μ、κ和δ受体缺陷的小鼠 ,为研究μ、κ和δ受体在药物依赖性中的作用提供了很好的实验模型。
2. 1μ阿片受体
μ受体基因敲除小鼠, 其后代符合孟德尔遗传规律, 28. 6 %野生型, 46. 6 %杂合子, 24. 8 %的纯合子 , 说明突变的μ受体基因缺陷小鼠没有发生宫内和出生后死亡。这种小鼠的生长、发育、生殖和活动周期等与正常小鼠无明显差异。放射配体结合实验显示 ,μ受体 KO 小鼠没有任何μ受体存在,但δ和κ受体的数量和分布未受影响[2 ]。
药物是选择性较高的μ阿片受体激动剂, 其对WT小鼠有很强的镇痛作用, 但在μ受体 KO小鼠不出现镇痛。在浸尾、甩尾和热板法镇痛试验中,对μ受体KO小鼠皮下注射药物达到 50 mg·kg- 1,鞘内或脑室内注射药物剂量达到WT小鼠镇痛ED50的15倍都不产生镇痛作用。表明μ阿片受体基因编码的受体对介导药物在痛通路中的作用是必须的。在同样实验条件下,药物在κ、δ受体KO小鼠仍有镇痛作用, 证明了κ和δ受体不参与介导药物镇痛。用条件性位置偏爱方法评价药物的欣快效应证明药物(3 mg·kg- 1sc)在 WT 小鼠产生 CPP 效应 ,而在μ受体 KO 小鼠不能引起 CPP 效应。慢药物物给药使 WT 小鼠形成身体依赖性, 纳洛酮诱发其出现戒断症状, 同样处理μ受体 KO 小鼠不出现戒断症状。重复药物给药使 WT 小鼠脑内腺苷酸环化酶的活性上调, 而在μ受体 KO 小鼠脑不产生腺苷环化酶活性上调 [3 ], 说明药物产生的精神依赖性和身体依赖性是μ阿片受体介导的, μ阿片受体基因编码的产物是药物药理效应的既定的分子靶位。
2. 2κ阿片受体
κ受体 KO 小鼠的自发活动与 WT 小鼠无差别。κ受体激动剂 U50488H 在κ受体 KO 小鼠不引起镇痛作用 , 也不形成条件性位置厌恶效应, 而在WT 小鼠出现,表明κ受体在κ激动剂作用中的重要性。药物在κ受体 KO 小鼠的镇痛作用和条件性位置偏爱效应与 WT 小鼠无差别, 但药物的戒断症状则明显弱于 WT 小鼠, 说明κ受体不参与药物的镇痛和奖赏效应, 但参与调节药物的身体依赖性[4 ]。
2. 3δ阿片受体
在δ阿片受体基因敲除小鼠,δ受体激动剂DPDPE 的镇痛作用在脊髓水平明显减弱, 但在脊髓上水平的镇痛作用与野生型无差异, 说明δ受体在不同部位的镇痛效应中所起的作用不一样。实验还发现δ受体敲除小鼠不对药物的镇痛作用产生耐受性 [5 ], 但δ受体敲除小鼠在依赖性中的作用还有待于进一步研究。
3 敲除多巴胺受体或多巴胺递质转运体基因
多巴胺 (DA) 系统是药物精神依赖性的神经基础, 中脑边缘DA 系统是“奖赏系统”中最重要的一环。DA 受体亚型有两类: D1 样 (D1 和D5 受体) 和D2样(D2、 D3 和D4 受体) ,不同的DA 受体亚型在药物奖赏中发挥的作用也不相同。利用基因敲除技术已经培育出了D1、 D2、 D3、 D4 受体缺陷的实验小鼠,为探讨DA 受体在药物奖赏效应中的作用提供了依据。
3. 1 D1 受体
D1 受体 KO 小鼠基础性活动多于 WT 小鼠。可卡因能使 WT 小鼠活动增加,而不能使D1 受体 KO小鼠活动增加, 但可卡因的位置偏爱效应在两种小鼠都出现[6 ]。苯丙胺反复给药的行为敏化现象在D1 受体 KO 小鼠低于 WT 小鼠; 苯丙胺在D1受体KO小鼠和WT小鼠都形成自身给药, 但 KO 小鼠的阳性反应率低于 WT 小鼠[7 ]。这些实验说明D1 受体激活可能是可卡因、苯丙胺运动增强效应所必需的,而不是奖赏效应所必需的。但这与正常 WT 型的实验结果不一致, 因为在正常鼠, D1 受体拮抗剂可抑制药物的自身给药和偏爱效应。造成这种不一致的原因可能与受体拮抗剂的特异性有关, 也可能与基因敲除小鼠的遗传异常有关。
