利用异型双功能连接器把单克隆抗体结合到黄金纳米粒子表面,参考35。简单地说, 抗EGFR的单克隆抗体(克隆29.1.1σ)要用一个100 kDa的MWCO离心式过滤器来从腹水中剔除，并在40 mM浓度为1 mg/mL的HEPES溶液(pH 7.5)中悬浮处理。添加高碘酸钠(NaIO4)到抗体溶液中，并最终在弱风潮,防止光线条件下保存30分钟。浓度在最后10毫米为30分钟,。高碘酸钠将位于抗体糖化基区域的羟基氧化成醛基。然后,用1× PBS将溶液稀释50倍，然后添加200μM的异型双功能连接器(Sensopath科技有限公司)。

这个连接器有一个PEG链和一个酰肼组成，PEG链包含两个在一端的sulfhydril群组。这个新合成的醛在连接器上与酰肼群组被浓缩,残余的硫醇可用在绑定黄金表面上。多余的未反应的连接器如上所述通过离心过滤被移除, antibody-linker（抗体连接器）溶液储存在1mg/ mL, 1×PBS中4周时间。在这之前，要标记细胞, 抗体连接器溶液首先在40毫米的HEPES中稀释100倍, 相当于添加等体积25 nm金纳米粒子。这两个部件混在一起柔和搅拌20分钟,紧随其后的是增加5 kDa单功能硫醇盐的聚乙二醇(mPEG-SH, Nektar)，达到10-6 M的最终浓度。在添加mPEG硫醇五分钟后,抗体纳米粒子连接器在3400 × g的条件下减速旋转30分钟，然后除去上层清夜。将连接器在含有10% FBS的无酚酞细胞培养基中再次悬浮处理。

使用直径25 nm金粒子是因为在探测EGFR表译A431 细胞29时可以提供很高的对比度。结合了抗体的粒子，不会通过EGF36来阻止受体反应。我们在先前的研究已经证明, 不管是单功能硫醇盐的聚乙二醇(mPEG-SH)还是非特异性抗体与纳米离子结合都不会影响EGFR表译细胞。与单功能硫醇盐的共轭粒子聚乙二醇(mPEG-SH)或非特异性抗体不与表皮生长因子受体表达细胞。而且在无抵抗EGFR抗体条件下检测出的取代和竞争现象显示了绑定金连接物的EGFR的特性29。

活细胞的动态影像。

A431角质化细胞培养在22毫米平方的盖盒内，F-12(50 / 50)细胞培养基增长介质在37 ?C 、 5% CO2条件下辅以5%的FBS来培养。对于活影像实验,将A431细胞植入到光学成像流动腔中(ibidi μslide chambers, Integrated BioDiagnostics)，让其附着过夜。然后将腔分入两个样品中-腔和控制腔。腔中细胞暴露在10 μM AG1478 (Calbiochem 一种新的磷酸化抑制剂)下，控制腔内的细胞不暴露在抑制剂下。然后再将样品在血清饥饿条件下保存24小时。把腔放在显微镜下，连接到蠕动泵上以低流速(通常 ?1 mL/min)供给DMEM (含10% FBS)介质或者供给纯DMEM金纳米连接物。用内置电阻加热器来控制温度，在引进腔之前，先将温度提升到37度。

在延时影像过程中，样品以大约1012粒子/ mL的低流量在连接器中持续暴露45-60分钟。用莱卡DM6000直立显微镜像，辅以100瓦卤素光源和数值孔径为1.2的油浸暗场镜头(Leica) 采集图。用一个长工作距离(1.2 mm)、 0.75 NA、63倍的物镜(Leica)来采集散射的信号，用高敏感度的12字节的色拼CCD照相机(SPOT Pursuit XS, Diagnostic Instruments)来记录图像。为确保整个活动影像实验的细胞活力，在细胞暴露在抗EGFR纳米颗粒连接物中2小时后，我们执行钙黄绿素AM实验(分子探针)。结果显示金纳米粒子标定的细胞与未标定的细胞的稳健性在统计上没有显著的改变。

图一活细胞动态影像。(A)依据配合基绑定的EGFR交易图。在标定抗EGFR金纳米粒子活细胞中这个进程是在显微镜下实时监控的。(B)活A431细胞和(C)用 10 μM AG1478（降低内吞作用）预处理的活细胞。从左到右分别为从初始暴露到纳米粒子到0, 15, 30和50 分钟后图像显示金纳米粒子光学信号的颜色和强度的变化。未经处理的暗场图像的色彩从蓝到黄橘色的变化，这是经过处理的细胞显示不出来的。图B中最右边的箭头显示邻近细胞放射出来的丝线。图像的获取要求使用透射暗场照明、长工作距离、63倍、0.75 NA的物镜。

标定抗EGFR纳米粒子的动态活细胞影像显示了连续的颜色变化，从绿到黄，最终到橘红(图 1B)。这些颜色的改变同步关联着已知的EGFR交易动力。起初EGFR的二聚和聚合是在质膜中，随后内吞成为早期的胞内体中。这些早期的胞内体可以再循环到细胞表面或者在20-60分钟内继续行进形成后期胞内体或MVB。AG1478（一种强有力的EGFR抑制剂）将打断连续颜色变化这种效果，因为它干扰EGFR的横穿磷化作用和内化作用(图 1C)37。这些数据表明已测的颜色变化与EFGR在细胞内的重组有关系，是配合基绑定造成的，也是由于细胞内的囊泡交易。在未经处理样品的图像里， 红色的相对强度从27%提到了34%(图 1B)，相反，对用AG1478抑制剂处理的样品这个数值的增长就只是28 % 到30%了(图 1C)。

在不同的温度下标定细胞。
为了在等振纳米粒子的散射反应和活细胞中EGFR机制的动力之间建立关系，我分别在4、25和37 ?C下进行标定。温度控制可以让EGFR的激活和交易机制在关键的点停止。在??C时细胞的EGFR内化被抑制。在25 ?C细胞的内化进行形成早期的胞内体，最终在37 ?C条件下1小时内通过形成多泡体和后期胞内体获得完整的EGFR调控机制33,38,39。对基于温度的实验，细胞要以50 000-100 000个/mL植入盖玻片，并让其附着过夜。然后用1× PBS和添加了5% FBS金纳米粒子生物连接物的补充培养基冲洗细胞，然后将包含纳米粒子细胞样品的盖玻片被放入4, 25, 和 37 ?C条件下，让其作用60分钟。随后纳米粒子从样品中被吸走，接着在1× PBS中冲洗细胞，并用已备的新鲜的4%甲醛在4 ?C条件下固定15分钟。在三种不同温度下标定的细胞的色彩图像显示了散射信号的明显变化，从绿(4 ?C, 图 2a)到黄(25 ?C, 图 2b)最终到橘红(37 ?C, 图 2c)。

图2 在不同温度标定细胞。图中显示标定了25 nm抗EGFR的金纳米粒子连接物的A431细胞在4 (a)、 25 (b)和37 ?C (c)条件下的暗场图像。暗场显微镜揭示样品的光散射。通过控制温度来阻止正常EGFR调控程序。在4 ?C时受体停留在细胞膜表面，在25和37 ?C时分别进行胞内体内化、多泡体分类拣选。(d, 4 ?C; e, 25 ?C; 和 f, 37 ?C) 完全相同样品的TEM显示了纳米级别EGFR的新排列，这种TEM图像与光学图像是对应的。图(g)，显示EGFR的调控阶段与有关金纳米粒子光学信号之间的定性关系。

标定细胞的透射电子显微图像(图 2d-f)显示了纳米级别EGFR的调控与温度有关的变化，这曾经被报道过39。在4 ?C时，纳米粒子被安放在小群集的细胞膜上。温度提高到25 ?C时会导致形成更三维、更饱满的结合形态，这与胞内体的摄取有关 。在37 ?C时，EGFR的交易进程导致出现了一个非常复杂的与MVB相一致的聚合结构。