利用具有pH检测控制和补料功能的新型摇床研究...（一）

利用具有pH检测控制和补料功能的新型摇床研究利福霉素SV种子培养过程

杜吉泉② 王军峰  储炬  王永红  庄英萍  张嗣良③
（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室  国家生化工程技术研究中心，上海 200237）

摘要： 种子培养过程中pH变化规律能够反映菌体对不同营养物质的利用情况及菌体生理特性的变化，可为移种时机的选择提供线索。在实际生产过程中通过取样来确定种子的生长状况存在较多弊端，而通过数学模型对种子的生长进行预测有很大的优势。本文利用具有pH检测控制与补料功能的新型摇床，得到了利福霉素SV种子的最适接种量范围为6～8%（v/v）及最适移种时间为对数生长期末期（判断标准为pH到达第二个低谷），并建立了预测菌体浓度的数学模型，检验证明此模型能够较准确地预测利福霉素SV产生菌在对数生长期及移种时（对数生长期末期）的菌浓，并可用于预测在一定接种量下达到预定菌浓所需的培养时间。

关键词： 具有pH检测控制和补料的摇床；利福霉素SV； 培养过程优化； 菌浓预测；数学模型

中图分类号：TQ920.6              文献标识码：A    

Studies on Rifamycin SV Seed Cultivation with
pH-controlled fed-batch shaker①
Du Ji-quan②, Wang Jun-feng, Chu Ju, Wang Yong-hong, Zhuang Ying-ping, Zhang Si-liang③
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, National Engineering Research Center for Biotechnology (Shanghai), East China University of Science & Technology, Shanghai 200237)

ABSTRACT  The  variety of pH during rifamycin SV seed cultivation responses to the consumption of substrates and usually can indicate the physiological characteristics of Amycolatopsis mediterranei. The process of vegetative seed cultivation was investigated with pH-controlled fed-batch shaker (ab. pH-shaker). The optimized time window for seed transferring was the second valley of the pH profile and the optimized inoculum amount was 6~8% (v/v). Furthermore, a mathematical model for predicting the PMV of the vegetative seed process was developed, which was proved suitable for logarithmic phase of vegetative seed growth.
KEY WORDS  pH-controlled fed-batch shaker; Rifamycin SV; Optimization of seed cultivation; PMV prediction; mathematical model

利福霉素（Rifamycin）是由地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）产生的一类安莎大环类抗生素，广泛应用于治疗结核病、麻风病和与艾滋病有关的分枝杆菌感染[1]。其最主要活性组分SV和B是利福平、利福喷叮等利福霉素类药物的直接前体[2,3]。目前我国利福霉素产量占世界产量的绝大部分，但生产水平经常出现波动，其中种子退化及种子质量控制不稳定是一个主要原因，因此种子质量的稳定控制意义重大。
菌丝浓度是反映种子质量的一个关键指标，对它进行在线测量目前仍是一个难题。利用数学模型对种子培养过程的菌浓及生长状况进行预测是快速估计菌体浓度的有效方法之一，黄明志等[4]曾经基于神经网络对发酵过程中细胞浓度进行了在线估计，并取得较好效果。

具有pH检测控制和补料功能的新型摇床（以下简称pH摇床），相当于一个多罐并联操作的简易型生物反应器，能够实现菌株大量快速筛选、种子扩大培养、生理生化特性研究、培养基优化、补料工艺优化等多种目的。Jutta Altenbach-Rehm等人[5,6]曾用类似装置对重组E.coli表达GDP-manPP的发酵过程进行了研究，结果利用优化后的诱导剂IPTG的添加策略使产物产量提高了一倍。本文利用pH摇床研究了利福霉素SV种子培养过程最适接种量和最适移种时间，并针对对数生长期及移种时的菌体浓度建立了数学预测模型。

1  材料与方法
1.1  实验用菌株  
出发菌为地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）U-32，由同联集团上海研究所提供；实验用菌种为出发菌原生质体再生后筛选得到的Y-14高产菌株。
1.2  培养方法  
1.2.1 种子培养基[7]：母瓶与子瓶培养基配方相同。
1.2.2培养方法：甘油管接母瓶（一级种子），摇床培养48小时后转接子瓶（二级种子），子瓶于pH摇床上培养2天左右转接发酵瓶，发酵瓶在摇床上培养120小时放瓶。
1.3  主要仪器设备  
SPY50双层培养摇床（上海离心机械研究所）；SHpH-6型pH控制－补料摇床（上海国强生化工程装备有限公司）。
1.4  测定方法
菌浓为PMV法；化学效价为分光光度法[8]；pH为pH摇床在线测量及pH计离线测量。