实验方法原理

非常长且复杂的库经常需要若干毫升规模的 PCR 扩增。大规模 PCR 与常规 PCR的不同之处在于它一般在水浴中进行，而且需要使用 15 ml、17 mm×120 mm 的螺纹口盖子的热稳定管子（Sarstedt） 来容纳更大的体积。高至 2.5 L 体积的扩增反应都曾用这种方法做过。中等规模的扩增有时可以在能容纳多个样品（如 96 孔 PCR 板）的热循环器中进行。

实验材料 纯化的 ssDNA 库和引物

试剂、试剂盒 EDTA乙酸铵1：1 （V V） 苯酚 氯仿 氯仿乙醇TE 缓冲液

仪器、耗材 热循环器或三个水浴（其中之一必须是循环水浴）96 孔 PCR 板或 13 ml 热稳定管（Sarstedt）温度计聚苯乙烯泡沫塑料架子分光光度计或荧光计

实验步骤

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 在小规模水平鉴定出合适的 PCR 条件后，配制大规模反应所需的试剂。为大规模扩增留出时间，这往往需要一整天的时间。

如果大规模扩增反应的体积＜100 ml：

2a. 可以重复使用商品化的热循环器。预先配制好反应混合物，然后按每份 100 ul 的体积分装到 96 孔 PCR 板的每个孔中。

3a. 预先进行几个小规模的扩增反应以确保辅助方案中优化的条件也适用于 PCR 板，而且扩增反应在整块板上是一致的。

4a. 用 11 块 PCR 板进行整个反应的热循环过程。

对于更大的体积：

2b. 将温度计插入盛有 10 ml 水的 Sarstedt 管中来制作一个温度探针以确定反应混合物在管中需要多久才能达到热平衡。将此探针与其他类似的管子放在架子上。

3b. 为确保反应条件能如计划中的那样确实发挥作用，在架子上放上分别装有水、单独的一个扩增反应体系和温度探针的管子。将样品变性 30 min， 然后在首次复性后加入 Taq 酶。每一循环都取出一小份以监测反应进程。

4b. 反应条件确证后，继续下面的扩增反应。最后一步延伸要进行 20 min 以上以确保所有的模板都成为双链。

5. 扩增结束后，将各个孔或管中的反应液富集到一起，加入 1 mol/L 等量的 EDTA， pH 8.0螯合掉缓冲液中的镁离子。

6. 加入等体积的 2-丁醇进行抽提，将反应液浓缩到可操作的体积（通常为 10～20 倍）。涡旋振荡混合各层，然后室温下于 1200 g 离心 5 min， 弃上清-丁醇液层。如果需要可重复此步操作。

7. DNA 浓缩后，进行苯酚/氯仿抽提，随后进行两次氯仿抽提。

8. 需要的话可以在 13 ml Sarstedt 管中加入等体积的 4 mol/L 乙酸铵（终体积为 2 mol/L） 和两倍体积的乙醇沉淀出 DNA。

9. 用 TE 缓冲液（pH 8.0，含 50 mmol/L 盐，如氯化钾）重悬扩增出的 DNA。

10. 定量测定 PCR 产出的 DNA。

11. 大规模扩增后，于 -80℃ 存储至少 4 个拷贝的库。

此处 x 为库的总拷贝数，y 为得到的库的拷贝数

如果将通过扩增而产生 8 个库的拷贝中的 4 个存档的话，那么约 99.6％ 的起始库的复杂度将得以保存。同理，至少 4 个拷贝的库应当用于实验操作，如连接、转录或生物素化标记。这样的话，初始的复杂度在用于实验操作或合成的拷贝中也能得以体现。

收起 

注意事项

其他

1. 材料

纯化的 ssDNA 库和引物

2. 试剂

EDTA

4 mol/L 乙酸铵

1：1 （V/V） 苯酚/氯仿

氯仿

乙醇

TE 缓冲液，pH 8.0，含 50 mmol/L 盐，如氯化钾

3. 耗材

热循环器或三个水浴（其中之一必须是循环水浴）

96 孔 PCR 板或 13 ml 热稳定管（Sarstedt）

温度计

聚苯乙烯泡沫塑料架子

分光光度计或荧光计