实验材料 T4 DNA 连接酶感受态细胞

试剂、试剂盒 Taq 聚合酶PCR 缓冲液溴化乙锭（EB) 溶液过硫酸铵（APS) 水溶液

仪器、耗材 琼脂糖凝胶

实验步骤

3.1 克隆

NExT 混编过程中，使用包含限制性酶切位点的混编引物的配对位点应设置在紧挨着目标基因的两侧，理想的退火温度为 60°C 左右。通过 4 加 2 法则估算引物的退火温度：每个 G 碱基和 C 碱基为 4°C，A 碱基和 T 碱基为 2°C。

我们在 NEXT 混编过程中使用的基因包括：含 657 个碱基的野生型 CAT 基因 ( CATwt；SwissProt 编号： P00 483；蛋白质数据库（PDB) 编号：1NOC：B)，编码 N 端 10 个残基截短的突变体，C 端 9 个碱基截短和 N 端、C 端双截短 CAT 突变体 ( CAT_Nd10，CAT_Cd9 和 CAT_ Nd10_Cd9 ) 以及 C 端 26 个碱基截短突变体( CAT_Cd26)。这些基因和全部的混编基因都克隆到质粒载体 PLiSC-SAFH1 上[7]，使用 Xba l 和 Hind III 双酶切位点替换原始质粒的部分片段。多样性的产生则通过易错 PCR 和尿苷酸交换 PCR ( 见 10.3.2 节）。扩增野生型和 N 端截短的基因使用 Pr-Nshuffle  ( 5'- ATTTCTAGATAACGAGGGCAA-3' ) 和 Pr-C-shuffle ( 5’- ACTTCA CAGGTCAAGCTTTC-3'）混编引物；而对于扩增 C 端截短和双截短突变体的基因则使用 Pr- N-shuffle 和 Pr-Cdx-shuffle (5’-CTTCACAGGTCAAGCTTATCA-3’）引物。通过常规方法将这些质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中 [8]。

3.2 尿苷酸交换 PCR

选择尿苷酸作为交换核苷酸，因为许多种 DNA 聚合酶都可将 dUTP 引入基因序列 [9]。尿苷酸交换 PCR 在扩增目标基因库的同时，也引入了交换核苷酸，尿苷酸。通过改变 dUTP: dTTP 的比率可获得理想的 DNA 断裂效果。这一步骤的实现即可通过分析不同 U:T 比率的实验，详见 10.3.4 节，也可使用我们为此目的开发的程序（见 10.3.9 节）。使用高达 50% 比率的 dUTP 并不影响 PCR 产物的得率。只有在完全使用 dUTP 的情况下，PCR 产物的产量大约为其他反应的 1/4 ( 图 10.1A )。

( 1 ) 为精确加样量，将 100 mmol/L 核苷酸储液用水稀释到 dATP、dGTP 和  dCTP 的终浓度为 10 mmol/L ，dUTP 和 dTTP 终浓度 1 mmol/L。

( 2 ) 尿苷酸交换 PCR 混合液包括：50 ng 模板（对含 4340 个碱基的质粒为 0.017 pmol)，引物各  25 pmol，dATP、dGTP 和 dCTP 各 0.4 mmol/L，0.4 mmol/L dUTP : dTTP 不同比率的混合物，5U Tag DNA 聚合酶，5 μl 10 X PCR 缓冲液。用水加至终体积 50 μl ( 见注 1 和注 2 )。

( 3 ) 温度循环程序为 94°C 预变性 1 min；92°C 变性 30s，62°C 退火 20s，72°C 延伸 2 min，共计 25 个循环；最后 72°C 再延伸 4 min。其中将延伸时间延长至 2 min 是因为测试表明这样可以显著的提高产量（数据略去）。根据 PCR 的不同产量，需同时做 4 个或更多的 50 μl 反应体系以获得足够的产物（胶回收后应最好约为 7 μg DNA；见注 3 )。

( 4 ) 将得到的 PCR 产物合并，并通过 1% 的琼脂糖凝胶电泳分离纯化（见注 4)。如果量足够多的话，在日光下即可从胶上看到浅红色的条带。将条带切割下来后加到一两个胶回收试剂盒的离心柱中，用 50 μl 洗脱缓冲液洗脱。

( 5 ) 使用波长范围 220~350 nm 的分光光度计检测 260 nm 的基线校准吸光值，测定 PCR 回收产物的浓度。我们通常以 1 : 30 稀释后在 140 μl 的比色杯中测量。NExTDNA 混编产物最理想的得率为 7 μg DNA。更低的得率可能也行，但足够量的 DNA 可确保下一步的基因重组顺利进行（见 10.3.7 )。将所有理想的 DNA 都用于下步反应。

在这项研究中，我们均使用尿苷酸作为交换核苷酸，然而此项技术也同样适用于其他类似物的引入。例如，8- 氧化鸟嘌呤（8- oxoguanine) 可被 8-氧化鸟嘌呤 DNA 糖基化酶 FPG ( foramidopyrimidine-DNA glycosylate) 切除 [ 10 ]。该减基可用于 AT 富集区，那里 UDG 酶频繁的切割 DNA，也可用于缺少胸腺嘧啶的 GC 富集区。因此，将多种交换核苷酸结合在一起使用可以产生所需大小的片段，用于下一步的再组装。另外，在 PCR 引物中引入交换核苷酸应确保基因库中的这些区域同样被混编。