细胞工程（cell engineering）技术介绍
广义的细胞工程（cell
engineering）指所有应用于生物学和医学的、以细胞为操作对象的技术手段，其中也包括细胞培养。一般地说，细胞工程主要指应用各种手段对细胞不同结构层次(整体、细胞器、核、基因等)进行改造，如进行细胞融合、核移植、基因转移等，以获得具有特定生物学特性的细胞。
一．细胞融合技术
在细胞自然生长情况下，或在其他人为添加因素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程，即为细胞融合（cell fusion）。通过细胞融合，可将来源于不同细胞核的染色体结合到同一个核内，结果形成一个合核体的杂种细胞。
细胞在生长过程中，可能发生自发的融合，但几率很低。在实际工作中常采用各种促融合手段，包括病毒类融合剂如仙台病毒、化学融合剂如聚乙二醇（PEG）及电激融合法等。在进行细胞融合反应和适当时间的培养后，需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。
细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技术。细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建立和单克隆抗体技术的成功。
1975年Koehler和Milstein将用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合，获得了具有两种亲本细胞特性的杂交细胞，即既能在培养条件下长期生长增殖，又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的B淋巴细胞杂交瘤。对这种融合细胞进行克隆化以后，即可获得来自同一细胞克隆的抗体，这种抗体具有高度的均一性，称为单克隆抗体。
二．核移植技术
细胞核移植（nuclear
transfer）是指将一个双倍体的细胞核（可来自胚胎细胞或体细胞）移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母体，并能发育为与供核细胞基因型相同的后代，因此又称为动物克隆技术。1997年诞生的克隆羊“多利”就是体细胞核移植技术的产物。
核移植技术首先是选取合适的受体去核卵细胞和供体核。将获得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞卵周隙后，施加微电流脉冲，使核质融合，形成一个重组卵。重组卵需经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物输卵管内孵育，经过一段时间的培养，有的动物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受体子宫里。
实际上，胚胎细胞核移植技术的应用已有半个世纪的历史，德国科学家Spemann于1938年最先提出并进行了两栖类动物细胞核移植试验。中国学者童第周于1963年在世界上首次报道了将金鱼等鱼的囊胚细胞核移入去核未受精卵内，获得了正常的胚胎和幼鱼。
体细胞核移植也在上世纪六十年代在非洲爪蟾获得成功。1997年英国罗斯林研究所Wilmut首次报道以高度分化的成年母羊乳腺细胞为核供体克隆出小羊“多利”。“多利”的诞生在理论上具有重要意义，说明高等动物高度分化的成体动物细胞核仍具有发育的全能性。目前，通过体细胞核移植获得的“克隆鼠”、“克隆牛”等均已面世。
三． 基因转移技术
基因转移（gene
transfer）指向受体细胞中导入外源基因，是改造细胞遗传性状的常用手段。一般情况下，能稳定接纳外源基因的细胞只有受体细胞总数的千分之几。因此为了快速有效地筛选转化细胞，一般在转入基因中携带有特定的选择标记，目前应用较多的为细胞抗药性筛选，如根据新霉素抗性基因进行筛选。基因转移又常称为基因转染（gene
transfection）。
1． 物理学方法 包括电穿孔、显微注射、裸露DNA直接注射。
电穿孔法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米大小的微孔，使外源DNA转移到细胞中。该方法较为简单，广泛应用于培养细胞的基因转移。
显微注射法主要用于制备转基因动物。该法的基本操作程序是：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后从雌鼠输卵管内取出受精卵；借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄性原核内；将注射了基因的受精卵移植到假孕母鼠输卵管中，繁殖产生转基因小鼠。该方法转入的基因随机整合在染色体DNA上，有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或点突变。
裸露DNA直接注射法是最简单的基因转移方法。将裸露DNA直接注射到组织后，DNA有可能直接被细胞所摄入。外源基因进入细胞的效率与局部组织或细胞的损伤程度有关，基因在体内的表达时间与机体的免疫功能有关。
2．化学方法 基因转移的化学方法包括DEAE－葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体法等，是通过增加细胞膜的通透性、增加胞吞或胞饮、增加DNA与细胞的吸附等机理而实现基因转移的。这些方法多用于培养细胞的基因转移。
DEAE－葡聚糖法将外源DNA片段与DEAE－葡聚糖等高分子碳水化合物混合，形成的含DNA的大颗粒黏附于受体细胞表面，通过其胞饮作用进入细胞内。这种方法的转染效率较低。磷酸钙共沉淀法是使待转化的DNA与磷酸钙共沉淀形成大颗粒，颗粒悬液与细胞一起孵育，颗粒通过胞饮作用进入细胞。该方法转染效率至少是DEAE－葡聚糖法的100倍。脂质体（lipofectin）法令脂质体试剂与DNA作用将DNA分子包入其囊状结构中，携带了DNA的脂质体可与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质和细胞核内。该方法基因转移效率很高。
3．生物学方法
基因转移的生物学方法主要指病毒介导的基因转移。根据受体细胞类型的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转染载体。目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病毒载体、猴肿瘤病毒载体、牛痘病毒载体）、反转录病毒载体等。用作基因转导的病毒载体都是缺陷型的病毒，感染细胞后仅能将基因组转入细胞，无法产生包装的病毒颗粒。这种方法的缺点是：所有的病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应；都或多或少地存在一定的安全隐患；而且转导能力有限、不适于大规模生产。
