呼出气冷凝液（EBC）采集与分析应用研究
一、 呼出气冷凝液及其组成
呼吸是人体重要的生理过程，呼出气的主要成分是水蒸气，同时还含有二氧化碳等其他气体和物质。呼出气冷凝液（Exhaled Breath Condensate，简称EBC）是在呼出气采集装置的辅助下，将呼出气快速低温（如-5℃）冷凝成的液体。
从来源看，呼出气冷凝液（EBC）是在无创条件下获得的下呼吸道衬液，推测认为是呼吸气流形成“气旋”将气道内衬液“刮落”或是吸气时气道扩张形成的张力将表层液相“撕裂”所致。EBC中大约含有0.1% 呼吸道衬里液滴和99%的水蒸气，即1mL的EBC仅含有0.1μL呼吸道衬里液，因此，EBC是一种内容物浓度极低的高度稀释的基质。从呼出气冷凝液的组分来看，其组分十分复杂，包括多种无机气体、挥发性有机化合物、低挥发性的有机分子，如醛类、脂肪酸和多肽等、过氧化氢（H2O2）、无机盐类如硝酸盐、生物大分子如蛋白质与核酸，以及含有细菌、病毒和真菌的生物气溶胶等等（见下表一）。
二、 呼出气冷凝液生物标志物（biomarker）的研究和临床应用
在Medline（生物医学）数据库中搜索呼出气冷凝液相关文献，通过PubMed使用 “Exhaled breath condensate”关键词可搜索到1705篇文献（2001~2021年）；通过PubMed使用“Exhaled breath condensate and biomarker”两个关键词可搜索到相关文献894篇（2001~2021年），可见人们对呼出气冷凝液（EBC）的研究热情一直非常高，且创新性论文增长迅速，几乎涵盖现代呼吸医学的所有领域。
I.生物标志物的研究
大量研究表明，呼出气冷凝液中的多种生化物质的浓度变化（或有无的变化）与呼吸系统的病理状态密切相关，这些生化物质被称为潜在的生物标志物（biomarkers），它们很有希望应用于临床诊断：科研工作者通过收集并分析含有生物标志物的EBC样本，从中发现各种生物标志物与疾病之间的关系，进而深入了解和洞悉疾病的发生发展机制和机理等，应用于如肺癌的早期诊断和高危人群中的筛查；哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等呼吸道疾病的动态监测、疗效验证和病情评估等方面。
与呼吸道炎症和氧化应激相关的潜在的多种生物标志物得到广泛而充分的研究。如pH、过氧化氢，白三烯（LTs)，8-异前列腺素和细胞因子等生物标志物。
pH代表呼吸道表面黏液的酸化程度，呼吸道的炎症与气道酸化即EBC-pH降低相关，如研究表明哮喘加重期、COPD 患者的EBC-pH较正常人低，支气管哮喘的吸烟人群EBC-pH 降低。
过氧化氢（H2O2）是人体氧化应激的标志性产物之一。EBC-H2O2的水平与肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺纤维化等疾病的关系都有深入的研究。如研究发现：非吸烟者哮喘患者的EBC-H2O2水平显著高于健康受试者，特别是成人哮喘患者的EBC-H2O2水平高于健康受试者，而哮喘患儿EBC-H2O2浓度与对照组间差异无统计学意义。此外，EBC-H2O2水平与哮喘的严重程度和控制状态相关，所以过氧化氢有可能作为指导哮喘治疗的生物标志物。大量研究发现慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中EBC-H2O2也显著升高，但急性COPD患者经治疗后EBC-H2O2降低。
白三烯（LTs）是白细胞产生的花生四烯酸（AA）经5-脂氧合酶（5-LOX）途径代谢产生的一组炎性介质，包括白三烯B4(LTB4)、半胱氨酰基白三烯(CysLTs)等，其中白三烯B4(LTB4)是目前所知作用最强的粒细胞趋化因子，如在哮喘和COPD患者中能发现EBC-LTB4的升高。半胱氨酰基白三烯(CysLTs)具有诱导平滑肌收缩，增加血管通透性，刺激黏液分泌并减少黏膜纤毛清除率等作用，它们参与包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管哮喘、支气管扩张等多种气道炎症性疾病的发病过程。前列腺素E2（PGE2）和8-异前列腺素也是花生四烯酸的衍生产物，PGE2有促炎作用和抑制支气管收缩，EBC-PGE2水平的升高可能反映了哮喘患者的吸烟状况。 8-异前列腺素是花生四烯酸被自由基氧化后生成的产物，被认为是测定体内氧化应激的金指标。在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤、哮喘和儿童呼吸道炎症等多种肺部疾病中，研究发现EBC-8-isoPG水平都有显著的升高。
细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞（主要为免疫细胞）所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，它们具有调节细胞生长、调节免疫应答、参与炎症反应、肿瘤消长等多种生物学功能。在EBC中发现了多种与哮喘，COPD及肺癌相关的细胞因子生物标志物。如促炎细胞因子白细胞介素（ILs），其中IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和IL-17在哮喘稳定期表达升高；儿童哮喘人群中，EBC-IL-4水平升高，同时干扰素γ水平降低。肿瘤坏死因子TNF-α也是炎症标志物之一，在急性COPD,哮喘和肺癌患者中均发现EBC-TNF-α水平升高。
下表二中列举了部分文献报道的生物标志物的研究成果。
应该指出的是，近些年来，EBC蛋白质组分析、基因组分析以及代谢组学分析的研究越来越多。EBC组学分析取得了很多令人印象深刻的研究结果。如对EBC的广泛蛋白质组学分析揭示了与哮喘的病理生理机制相关的生物标志物。在Bloemen 等人的研究中，哮喘儿童的EBC-细胞角蛋白1水平显著高于健康对照组，而EBC-细胞角蛋白2、5、6、8、9、10、14和16、白蛋白、肌动蛋白、血红蛋白、溶菌酶、钙颗粒蛋白B和结蛋白的浓度没有显著差异。在EBC基因组分析方面，如对肺癌患者的EBC基因组分析，检测到p53基因的体细胞突变，而在健康对照组中未检测到；对NSCLC患者的EBC分析发现微卫星DNA不稳定性和杂合性缺失：3p染色体(位点D3S2338、D3S1266、D3S1304、D3S1289)。对重度吸烟者和NSCLC患者中都发现了相同的微卫星EBC-DNA变化。Eva Borras等人研究了流感感染者和流感疫苗接种者的呼出气冷凝液的生物标志物。通过液相色谱法结合四极杆飞行时间质谱仪（LC-qTOF）的检测技术对呼出冷凝液（EBC）样品进行分析，使用靶向和非靶向方法分析所有代谢组学数据，以检测炎症和氧化应激生物标记物中的特定已知生物标记物，以及与特定感染相关的新分子。研究结果表明能够找到流感疫苗接种前后采集的呼吸样本之间的明显差异，以及与炎症过程和氧化应激相关的潜在生物标志物等。这些结果为进一步研究甲型流感和其他病毒在人体系统中的作用提供了非常有希望的信息。Annalisa Campanella等则根据EBC肺癌候选生物标记物的来源（基因组、转录组、表观基因组、代谢组、蛋白质组和微生物群）将其进行分类，证明EBC分析在癌症诊断、分子分析、治疗监测和高危人群筛查中的潜在用途。
II.临床应用
EBC分析广泛应用于肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、职业性肺损伤等肺部疾病的临床研究，也有不少关于细菌或病毒性呼吸道感染，包括最近两年来席卷全球的新冠病毒肺炎的研究报道。前面讨论EBC的生物标志物时能够看到很多的EBC分析在肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病等肺部疾病的临床应用的例子，在此不再赘述。
在EBC-细菌和病毒研究方面，如Yunhao Zheng等人使用商业化的EBC收集装置(北京鼎蓝BioScreenII)与LAMP（环介等温扩增）方法相结合,研究呼吸道感染症状的受试者的EBC中可能存在的细菌性病原微生物。研究结果证明流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和MRSA，可以通过呼出的气体从感染者中释放出来,也证明了流感嗜血杆菌是导致常见呼吸道感染的主要病原体。研究表明EBC结合LAMP分析方案提供了一种可能的快速、有效、无创的感染病原体的诊断方法。
在新冠病毒肺炎的临床应用方面，在pubmed中输入“Exhaled Breath Condensate，COVID-19”关键词，可搜索到15篇相关文献，这些研究为EBC分析在新冠肺炎的临床诊断等方面做了初步而有益的探索。如Makoto Sawano等收集48名2019-冠状病毒疾病患者的EBC样本，并结合RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）技术（即RT-PCR）定量分析病毒的靶向E基因来确定病毒载量，对检测率和病毒载量相对于患者特征和发病天数的变化进行统计评估，研究结果表明需要机械通气与较高的病毒载量显著相关（p<0.05）；需要吸氧或机械通气、发病后少于3天、咳嗽或发热与较高的检出率显著相关（p<0.05）。在自发呼吸患者中，EBC-病毒载量随时间呈指数衰减。发病后第2天的检出率为86%，此后恶化。在机械通气患者中，无论发病后几天，检出率和病毒载量都很高。这些结果支持了对发病后2天内的COVID-19患者使用RT-PCR技术检测EBC-新冠病毒的可行性。
三、 呼出气冷凝液采集装置与技术
I.呼出气冷凝液采集装置
目前临床研究上绝大多数EBC收集装置为商业化采集器，如R-Tube、EcoScreen、TURBO-DECCS、ANACON、BioscreenII等，适用范围包括自主呼吸和机械通气的患者。我们以呼出气采集器BioscreenII为例来介绍呼出气冷凝液的采集装置及技术。
BioscreenII是北京鼎蓝科技有限公司研发的呼出气冷凝液采集器，是一款便携且快速采集呼出气冷凝液（Exhaled Breath Condensate, EBC）的装置（见图1左）。该采集装置由采集器主机、电源适配器和一次性无菌采样耗材（分离盖、采集管和吹气管）组成。（设备详情请参考：http://www.dingbluetech.com/product/278199832）
BioscreenII的主要特点：（1） BioscreenII采用了先进的半导体制冷元器件和电动制冷方式，平均降温速率为5℃/min；选用50ml离心管，加大冷凝接触面积，进一步加快冷凝速度，使呼出气迅速液化形成冷凝液；（2）采集温度为-5℃~0℃，出厂默认-4℃，且能实时显示冷凝温度；（3）特有的分离盖设计，使呼出气在离心管内形成旋风气流，推动水雾形成液滴，减少液膜形成，同时可不断吹落侧壁冷凝液滴，汇集到冷凝管底部，提高了样品收集率，采集效率为200μL/min，3～5分钟就可采集0.5～1ml冷凝液；同时使采集者呼出的气体与唾液有效分离；(4)该装置外形尺寸为255*215*120mm，总重量2.0kg，轻巧便携。
图1 呼出气采集器BioscreenII（左）和 呼出气冷凝液的采集（右）
II.呼出气冷凝液采集技术
与支气管肺泡灌洗(BAL)等具有相对侵入性和挑战性的技术方法相比，呼出气冷凝液的采集无疑是一种先进的无创、轻松、无痛的技术，只需要被采集者简单地潮汐呼吸。
（1）采集原理
患者在平静呼吸时将呼出气吹进低温密闭采集装置（见图1右），同时装置的冷凝系统使气体凝结形成液滴并收集在采集管中，采集的样品可进一步低温储存或检测分析。
（2）采集过程
采集前，被采集者应该避免运动、抽烟或者进食一些特殊的食物如咖啡因类饮料、碳酸饮料等，因为有研究表明抽烟和特殊成分的饮料会导致EBCD的某些生物标志物浓度的变化；采集前先清水（或特定的溶液）漱口，休息十分钟，保持呼吸平静。当采集器的准备工作完毕，采集冷凝温度降至-5℃时，被采集者对吹气管均匀正常地吹气：吹气时保持用鼻吸气，用嘴呼；尽量将肺部余气吹出，有利于提高内容物的检出率。吹气采集时间一般为3～5分钟，采集结束后，立刻取出采集管进行低温储存或用于检测分析。
（3）注意事项
采集过程中需要特别注意的两个问题：一是防止EBC样品的污染，如在采集过程中防止采集管的污染，防止唾液、口腔和上呼吸道的内容物等对EBC的污染等。二是采集的EBC样品的维护，可根据检测分析的需要采取合适的低温（如-70℃）存储以防止样品中的生化物质的降解变质，必要时需将样品分装保存以防止EBC 样品的反复冻融等。
（4）面临的问题
各种不同品牌的商业化呼出气冷凝液采集器被广泛应用于EBC的研究，但研究者也注意到一些问题：（1）环境条件的不同，采集器装置和采集操作的不同，都可能导致采集到的呼出气冷凝液“内容物”有所不同。如有研究表明环境温度和相对湿度对EBC-pH的变化有贡献；EBC中的过氧化氢水平在48-140mL/s的呼气流量下具有流量依赖性等。所以，对不同品牌收集器的呼出气冷凝液进行比较研究，对EBC收集操作进行标准化也是EBC研究面临的课题之一。（2）另一个应用的难题是EBC是一种含有大量水蒸气的基质，因此大多数生物标志物被高度稀释，接近较低的检测灵敏度极限，有必要建立一个能够反映气道中各生物标志物实际水平的EBC稀释指标，但目前还没有金标准稀释因子（gold standard dilution factor）被定义并广泛用于研究。另外，从采集的角度来看，更有效地采集与富集装置也有待研究，如研究发现：将呼出气冷凝液（EBC）冻干再进行检测分析，则其生物标志物的浓度可有效提高20倍。
四，总结与展望
EBC分析是一种有临床应用前景的肺功能指标检测新技术。一方面，呼出气冷凝液(EBC)提供了一种新的诊断呼吸系统疾病相关的生物标志物的标本，通过分析EBC的生物标志物的变化，可提供下呼吸道和肺部可能的病理状态的信号，用于疾病早期的诊断、筛查，监测病情进程与疗效评估，也能为疾病的发生、发展机制提供诸多有用信息等。另一方面，呼出气冷凝液收集设备具有便携的特点，且收集不受年龄、性别、病情程度的影响与限制等，几乎可以应用于所有患者，包括小儿患者、机械通气患者及昏迷患者等。因此，EBC分析作为一种完全无创、简便快捷、应用人群广泛、可实现疾病动态监测等优势的新技术，受到众多的医学与科研工作者的重视与青睐。
目前EBC的研究还处于临床应用的初级阶段，尚还存在着很多亟待解决的问题，其中最主要的问题是“标准化”的问题：如（1）呼出气冷凝液作为一种如同血液，尿液的生化标本，其组分十分复杂，尚无大规模人群的研究报道，缺乏各种生物标志物在EBC中的正常参考值；（2）确定的正常人的呼出气冷凝液的蛋白质组学、代谢组学和基因组学“指纹”还没有被发现和没有被充分描述；（3）现有的知识（knowledge）基于小规模研究提供的数据，通常显示出相互矛盾的结果，可能归因于EBC生物标记物的再现性差；（4）EBC的稀释度在个体间存在着很大的差异，目前尚缺乏确定EBC稀释度统一的方法，从而可能会影响对检测结果的评估；（5）研究者所用的设备或收集及检测方法技术不同，可能得出不同的结果，也使得结果之间缺乏可比性等等。
总而言之，EBC分析是生物医学研究的一项有趣的成就，也是一项有希望成为肺部疾病及全身性疾病诊断的重要技术。特别是近些年来，随着基因组学、代谢组学和蛋白质组学等生命学科的飞速发展，同时分子检测分析技术也在高速发展，如高分辨质谱分析技术，核酸扩增-检测技术，以及生物样品处理与富集技术的突破与发展等，为EBC分析开拓了以蛋白质、核酸等生物大分子及细菌病毒微生物气溶胶为生物标志物的研究新视角和新领域。
主要参考文献：
1．Efstathia M. Konstantinidi et al.Scientific World Journal Volume 2015.
2．Eva Borras et al.J Breath Res. 2021 Aug 19；15(4).
3．Annalisa Campanella et al.J Breath Res. 2019 Aug 20；13(4).
4．Piero Maestrelli et al. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2020 Apr；20(2):85-89.
5．Michael D Davis et al. J Breath Res. 2020 Nov 12；15(1).
6．Yunhao Zheng et al. Journal of Aerosol Science，117（2018）224-234.
7．Makoto Sawano et al. J Breath Res.2021 Jun 10；15(3).
8．Lian Zhou et al. J Aerosol Sci.2021 Feb； 152: 105693
9．Daniel J Ryan et al. Thorax.2021 Jan；76(1):86-88.
10．Stefanos Patsiris et al. Adv Exp Med Biol. 2020；1195:13-18.
