定位候选克隆的基本步骤
定位候选克隆包括三个基本步骤：基因组定位、候选cDNA的获得、全长及功能分析。本文即对此策略的发展和应用作一概要介绍。
基因组定位
新发展起来的，尤其在分离肿瘤易感基因中常用的方法是用PCR方法检测多样本的杂合性丢失(LOH)或纯合性丢失的高发频率区，从而获得疾病候选基因定位。体细胞抑癌基因的失活是导致癌变的一个主要因素，最常见的表现即杂合性缺失。通常在染色体上杂合性缺失的高发频率区含有一个或多个抑癌基因。利用散布于各条染色体上的分子标记(包括STS、微卫星标记等)，用PCR检测多个肿瘤样本的染色体各区带的缺失情况，可确定LOH的高发频率区，也即确定了相关肿瘤生长负调控因子的染色体定位，并可精确到基因组分子标记指示的区域，进一步可作基因的克隆工作。利用这一方法已成功地克隆了几个抑癌基因，如乳腺癌中的BRCA1、BRCA2及胰腺癌中的DPC4基因等。同时，FISH技术的不断发展及推广应用，染色体显微切割技术的成熟，可在显微镜下切割特定的染色体区带，制备染色体区带特异探针，对正常和病变组织作FISH分析，比较确定疾病相关基因的染色体区带定位。近些年来，RH谱(radiationhybridmap)的建立，使染色体精细定位成为可能。这些方法比原先连锁分析的检测速度更快、精确度更高。例如L-CTsui用连锁分析花费了大约10年的时间才把囊性纤维变性基因定位在7号染色体，而现在可能只要一年或更短的时间就可完成这项工作。
候选cDNA的获得
基因组定位提供的信息包含一定的分子标记，可用PCR或杂交的方法直接从YAC(yeastartificialchromosome)库，或从BAC(bacterialartificialchromosome)库、PAC(P1artificialchromosome)库中筛选相对应的克隆。YAC库的嵌合性严重且操作难度较大，已逐步为PAC库和BAC库取代。PAC系统是以噬菌体P1为基础的克隆系统，它可容纳70～100kb的插入片段，并可选择性地区分重组子和非重组子，且同时有两套复制机制。单拷贝复制子可用于稳定克隆增殖，而多拷贝复制子则可在Lac操纵子的控制下用于DNA的制备。BAC系统是基于大肠杆菌中可大容量容纳基因且稳定性良好的F因子衍生而来的载体系统，可容纳超过100kb的插入片段，BAC克隆的插入片段的平均长度为120kb，最大可达到240kb左右。良好的稳定性和操作的简便性是BAC系统的主要优点。由这些克隆入手，采用依赖于适当cDNA文库的方法、依赖于特征序列的方法或依赖于表达性质等方法获得候选cDNA。
全长及功能分析
获得了众多的候选cDNA后，通过筛选cDNA文库或RACE等方法克隆全长基因。为确定其中的致病基因，需要逐个检测它们在患病家系中的变化情况，并分析其功能。功能分析往往是定位克隆中的一个难点，因为不同的疾病有不同的特征，也就需要用不同的功能检测系统进行分析。常用的如细胞水平的正义或反义基因的表达后细胞形态和功能变化的研究，在肿瘤研究中检测细胞形态和接触抑制的变化，软琼脂生长能力的变化及裸鼠致瘤性分析等。更进一步的功能分析则包括个体水平的基因敲除实验等。
现在还发展出了一些与其它方法相结合的新思路，如与差减杂交相结合，筛选位于候选区域的差异表达基因，大大提高了获得有价值基因的可能性。同时人类基因组计划中转录图谱〔15〕工作的开展，有很多EST已被精确定位于染色体的不同区带上，可以直接进行功能研究。随着研究的深入，越来越多的EST定位工作的完成，基因转录图谱的不断完善，我们完全可以直接跳过定位克隆的第二个步骤而直接进入功能鉴定和基因全长的克隆工作，这可能将是定位克隆中最快的方法。在分析分离手段不断提高，人类基因组计划紧锣密鼓地实施的今天，各种新思路新方法层出不穷，定位克隆方法的周期也将不断缩小，为人类最终克隆各种疾病基因提供了可能性。
