植物RNA提取实验——直接研磨法
植物RNA提取可应用于：（1）进行植物分子生物学方面的研究；（2）进行Northern杂交分析、纯化mRNA以用于体外翻译或cNDA文库构建等研究。
| 实验方法原理 | 通过裂解液β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H2O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、 新鲜植物组织称重后取100 mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100 mg放入研钵）， 加入10体积（1 ml）RLT(请确定已加入β-巯基乙醇)和1体积（100 ul） PLANTaid 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。 二、将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13 000 rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，取450 ul 裂解物上清转到一个新离心管。 三、加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。 四、将混合物(每次小于700 ul，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm离心60秒，弃掉废液。 五、加700 μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。 如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟后再离心。 六、加入500 ul漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500 ul漂洗液RW，重复一遍。 七、将吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 八、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 ul RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热效果更好）， 室温放置1分钟，12 000 rpm 离心1分钟。 九、如果预期RNA产量>30 ug，加30-50 ul RNase free water重复步骤7， 合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15-30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。 收起 |
| 注意事项 | 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13 000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 需要自备乙醇，β-巯基乙醇，一次性注射器（可选），研钵。 3. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 4. 植物组织裂解是否充分直接影响到RNA 提取的质量和产量，本试剂盒中提供的裂解液RLT，主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解，但有些植物组织（例如玉米的乳白色胚乳）或丝状真菌，由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生固化，导致RNA 无法提取，此时可以向我们索取另一种裂解液RLC，将解决该问题。 5. 关于DNA 的微量残留 一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时： 1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。 2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。 3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。 4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。 6. RNA 纯度及浓度检测 完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5xTBE电泳缓冲液；150 v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2 kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。 纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris， pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。 浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260，OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)x(稀释倍数n)x40 收起 |
| 其他 | RNA 纯度及浓度检测
完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150 v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2 kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris， pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260，OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40 |
