液相色谱法测定水产品中抗生素残留
方案优势
快速准确
采用标准
国家相关标准
方法/原理/步骤
实验方法
(1)土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准储备液的配制
分别称取O.0100mg土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品置于4个1Oml容量瓶中，分别加入甲醇溶解并定容至刻度，此溶液浓度分别为1.00mg/ml，置于冰箱冷藏室保存。
(2)混合标准中间液的配制
分别吸取土霉素、四环素标准储备液各1.00ml，金霉素、氯霉素标准储备液各2.00m1.置于100ml容量瓶中，用流动相A液定容至刻度，此溶液浓度分别为：土霉素(10μg/m1)、四环素(10μg/m1)、金霉素(20μg/m1)、氯霉素(20μg/m1)，置于冰箱冷藏室保存。
(3)标准使用液的配制
准确吸取混合标准中间液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml分别置于1Oml容量瓶中，用流动相A液定容至刻度，得到的标准系列为：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/m1(土霉素、四环素);0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/m1(金霉素、氯霉素)。
(4)流动相A液的配制
0.01mol/L磷酸二氢钠+0.001mol/L EDTA，用30%硝酸调至pH=2.0，经0.45μm双层水系滤膜过滤。
(5)流动相B液的配制
0.01mol/L磷酸二氢钠，用30%硝酸调至pH=2.0，经0.45μm双层水系滤膜过滤。
(6)样品前处理
准确称取5.00g搅碎的水产品于5Oml带盖的塑料离心管中，加入20%高氯酸溶液15ml，涡旋1min，将此离心管放入超声波清洗器中提取20min后，用离心机离心10min，收集上清液于25ml容量瓶中，往残渣中加入1Oml 2%高氯酸溶液，用玻棒搅动使样品均匀分散于高氯酸溶液中，将此离心管放入超声波清洗器中提取20min后，用离心机离心10min，收集上清液于上述25ml容量瓶中，合并两次上清液，用2%高氯酸溶液定容，取该提取液1O ml经已调节的固相萃取小柱吸附，用10%甲醇水2ml冲洗固相萃取小柱，用50%甲醇水1ml洗脱后收集备用。
(7)样品测定
吸取样品溶液20μl进样，进行HPLC分析，记录四种抗生素的峰面积。根据4种抗生素的保留时间和紫外吸收光谱图定性，峰面积定量。
仪器设备
仪器与试剂
LC7000型高效液相色谱仪，LC7060二极管阵列检测器，LC7050自动进样器;SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm色谱柱。固相萃取小柱为ZORBAX SPE C18Cart。12头固相萃取真空富集装置(Alltech Scientific Limited)。超声波清洗器KS—500D，超速离心机LD4—2，搅肉机，涡旋混合器。甲醇(色谱纯)，磷酸二氢钠(分析纯)，EDTA(分析纯)，高氯酸溶液(优级纯)、硝酸(优级纯)。土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品(SIGMA公司)。
高效液相色谱分析条件
色谱柱为SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm，流动相为0.O1mol/L磷酸二氢钠+0.001 mol/L EDTA:甲醇=60:40(V/V，pH=2.0)，流速为0.8ml/min，检测波长为268nm柱温为25℃，进样量为20μl。
结果与结论
结果
1、色谱分离条件的选择
(1)检测波长的选择
土霉素、四环素、金霉素在268nm、355nm处各有1个吸收峰，氯霉素在278nm处有1个吸收峰，分别在波长268nm、278nm和355nm下用高效液相色谱仪以4种抗生素的混合标准进行测定，结果表明:在波长268nm下4种抗生素色谱峰分离较好且测定灵敏度明显高于278nm、355nm处，实际样品在此波长条件下的溶剂峰对4种抗生素的测定无影响，故选择测定波长为268nm。
(2)流动相的选择
流动相配比的选择
为了有利于色谱峰的分离，选用0.01mol/L磷酸二氢钠溶液和甲醇的混合液为流动相。分别进行V磷酸二氢钠：V甲醇=70：30、65：35、60：40、55：45的试验。由所得色谱图及测定数据可以看出，随着流动相中甲醇含量的增加，4种抗生素测定的灵敏度升高，保留时间减少，但色谱峰分离变差。权衡分离度和保留时间，本方法选用V磷酸二氢钠：V甲醇=60：40为流动相。实际样品在此流动相条件下的杂质峰对4种抗生素的测定无干扰。
流动相的优化
流动相中0.001mol/L EDTA二钠可以使分离效果更好。
流动相中加入EDTA二钠，提高了方法的精密度。原因是四环素类抗生素分子中含有酚羟基和烯醇基，易与二价金属结合，因而造成重现性差，流动相中加入适量EDTA二钠可以改善这种现象。
2、样品前处理条件的选择
(1)样品提取液的选择
用高氯酸水溶液作为提取液是因为4种抗生素都能够溶解于水，高氯酸可沉淀水产品中的蛋白质。用鱼肝样品分别做浓度为0.1%、2%和5%高氯酸溶液的抗生素提取试验，随着高氯酸浓度的增大，样品中的蛋白质沉淀更加完全，有利于提取液的过滤，但高氯酸浓度过大不仅会对溶液中的抗生素起一定的破坏作用，影响测定的灵敏度，而且也会造成试剂的浪费，综合考虑过滤的效果及测定的灵敏度，选取高氯酸浓度为2%。
(2)全自动固相萃取条件的选择
反相固相萃取程序：调节-上样-冲洗-洗脱
调节:在本研究中，先用2 ml甲醇冲洗固相萃取小柱，再用2ml水冲洗固相萃取小柱。
上样:将样品加到固相萃取小柱上。
冲洗:在本研究中，用10%甲醇水将干扰物冲洗下来。
洗脱:在本研究中，用50%甲醇水将4种抗生素洗脱下来，收集样品用于分析。
固相萃取条件的选择实际上是洗脱液的选择:混标中每种抗生素的浓度为0.5μg/ml。
洗脱液准备：配制O%、10%、20%、30%……100%甲醇水
试验步骤:用11支固相萃取柱经调节后，分别上样10ml上述混标，分别用0%、10%、20%、30%……100%甲醇水各1ml洗脱，收集洗脱液，进行HPLC测定，以各种抗生素的浓度为纵坐标。甲醇水浓度为横坐标作图，得到固相萃取曲线，并计算最佳萃取条件下4种抗生素的固相萃取回收率。
试验结果：随着洗脱液中甲醇含量的升高，土霉素、四环素的分离度明显下降，各色谱峰的峰宽增大;另一方面，随着洗脱液中甲醇含量的升高，洗脱液中4种抗生素的浓度急剧上升，用10%甲醇水洗脱时，洗脱液中四种抗生素的浓度为0，至50%甲醇水时，四种抗生素的浓度已达最大5.0μg/ml，而这时土霉素、四环素仍能够很好分离，因此，选定最佳洗脱液为50%甲醇水，在此固相萃取条件下的固相萃取回收率分别为:土霉素100.6%、四环素99.2%、金霉素100.8%，氯霉素98.8%。固相萃取能将四种抗生素的检测灵敏度提高l0倍左右，鱼肝不经固相萃取及经固相萃取的样品都作HPLC测定，两者的HPLC谱图比较发现，经过SPE萃取柱纯化并浓缩的样品，杂质峰较少，土霉素峰清晰，并可看到四环素峰;而未经固相萃取的样品土霉素峰很低，杂质峰多，检测不到四环素。
3、方法的线性和最低检出浓度
用土霉素、四环素浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/ml，金霉素、氯霉素浓度分别为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/ml的混合标准溶液，在规定的色谱条件下，进样20μl，进行测定，求4种抗生素的响应峰面积—浓度的线性回归方程，其回归方程及相关系数r分别为:
土霉素：Y=56.3215x-0.9004.r=0.9999;
四环素：Y=42.8345x-1.1484.r=0.99991
金霉素：Y=23.0097x-0.9630.r=0.9999;
氯霉素：Y=38.8332x+0.1655，r=0.9999。
表明在该浓度范围内呈线性关系，符合定量要求。
以基线噪音的3倍计算方法的最低检出浓度，土霉素(0.018 mg/kg)、四环素(0.025 mg/kg)、金霉素(0.043 mg/kg)、氯霉素(0.010mg/kg)。
4、方法的回收率和精密度
以空白鱼肉样品为本底，分别加入不同量的抗生素，测定方法的加标回收率及精密度(每个样品平行测定6次)。
结论
通过高氯酸沉淀蛋白质、超声波提取样品、固相萃取的前处理方法，以及优化高效液相色谱条件下，成功地进行了水产品中土霉素、四环素、金霉素、氯霉素四种抗生素残留同时进行固相萃取和高效液相色谱测定的方法研究，目前已检测虾、蟹、鲩鱼、鲫鱼共印份。实验结果表明：该方法测定灵敏度高、稳定性好、简便易行，四种被测组分色谱分离效果好。
