补体介导的细胞毒实验
| 实验方法原理 |
带有特异抗原的靶细胞（如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞）与相应抗体结合后，在补体的参与下，引起靶细胞膜损伤，导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。染料（例如：伊红-Y、台盼蓝）可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色，故可用于指示死细胞或濒死细胞，而活细胞不着色。此即补体依赖性细胞毒试验，利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原，亦可鉴定抗体的特异性。 本实验中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T 细胞特异的表面抗原，在体外利用抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体通过补体的协同作用，可杀伤95％以上的胸腺细胞。 |
|---|---|
| 实验材料 | 小鼠 |
| 试剂、试剂盒 | Hank's液 抗小鼠Thy-1的单克隆抗体 补体 伊红-Y染液 |
| 仪器、耗材 | 解剖器械 平皿 不锈钢网 试管 吸量管 尖吸管 载玻片 盖玻片 |
| 实验步骤 |
1. 小鼠胸腺细胞悬液的制备 将 4～6 周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死，取出胸腺放入已加入约4 ml冷Hank's液的平皿中，在100 目的不锈钢网上研磨后，过筛，放入试管，离心1000 rpm，5 分钟，用Hank’s液洗两次。将沉淀的细胞重悬于Hank's液中，配成1×107 /ml细胞悬液。 2. 取试管3 支，标明顺序，依据下表依次加入1×107 /ml胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体（最适稀释度）及Hank's液，放入37 ℃水浴30 分钟。 3. 取出后每管加入1 ％伊红-Y 染液1 滴，混匀，室温放置2 分钟。
4. 重新混匀后分别在一张载玻片上滴片，加盖玻片镜检。先在低倍镜下观察，再用高倍镜观察，比较3 管中细胞死活情况。
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| 注意事项 |
1. 胸腺细胞制备速度要快，且需在冰浴中进行操作，以保持细胞活力。 2. 抗Thy-1 的单克隆抗体和补体的效价要在预实验中确定。 3. 细胞对照管死细胞数若超过5％，实验需重新做。 4. 细胞滴加到载玻片上后长时间放置不检测也可导致假阳性反应。
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| 其他 |
一、实验结果 死细胞呈红色，无光泽且肿胀变大；活细胞不着色、有光泽且形态正常。 高倍镜下计数 200 个细胞并计算其中死细胞的百分数。
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