HPLC的应用以及方法开发（2）
9.了解系统的滞后体积(梯度);
具体操作步骤：
(一)选择HPLC检测器：
对样品有响应并有一个输出信号;
应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系并且所设计的校正技术应该促进这种关系;
但是：
由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象;
并不是所有的检测器是线性的;
受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距;
(二)用于HPLC的检测器：
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离!
1.HPLC检测器可以分为：
溶质性质检测器(选择型)：
对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化(选择型);
整体性质检测器(通用型)：
不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应(通用型);
2.理想的HPLC检测器：
高灵敏度;
可忽略的基线噪音;
宽的线性范围;
独立于流动相及操作参数的响应;
对压力、温度及流速等变化不敏感;
长时间操作的稳定性;
低死体积;
非破坏性;
选择性;
(三)吸光度(V/Vis)检测
1.原理：
基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收;
2.定量基础：
比耳定律：A=KCL;
①优点：
1)对温度和流速不敏感;
2)可用于梯度洗脱;
3)灵敏度较高，ng级检测;
②缺点：
选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质;
3.应用
大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器;多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器(其中，50%以上是紫外/可见检测器，25%是PDA)。
背景吸收的影响
光电二极管矩阵(Photo Diode Array)
光电二极管矩阵检测器(PDA)的特点和用途
※一种三维水平的吸光度检测器——采集三维谱图;
※兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息：
在收集色谱图的同时，得到光谱图;
※提供许多有用的功能：
色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认;
可以发现单波长检测时未测到的峰;
任意波长的色谱再处理;
光谱信息—光谱库的建立检索和拟合;
※荧光(Fluorescence)检测原理：
原理：发荧光的化合物吸收光(UV或VIS)使其分子达到激发态，当其返回到基态时发射光的现象，即，荧光;
优点：荧光检测器灵敏度高，pg级检测;
缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生;
※荧光检测器的应用
环境中的污染物
多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等。。。
食品、饮料
食品中的毒素;例如，黄曲霉毒素;
染料;
维生素及衍生氨基酸;
生物技术及制药
（四.）示差折光(Refractive Index)检测
示差折光检测器(RI)是第一个商品化的液相色谱检测器(上世纪六十年代末、七十年代初)
通常被认为是一种通用检测器;
检测溶液中所有被溶解的溶质——非特异性;
任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值
1.原理：
连续测定流通池中溶液折射率来测定试样
各组分浓度。
优点：
通用型检测器
缺点：
1)对温度变化敏感;
2)不能用于梯度检测;
3)灵敏度低，μg级检测;
示差检测器的应用
示差折光检测器是通用型检测器，如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测;
特别适用于检测没有紫外吸收的化合物，例如，糖类、醇类、酯类以及脂肪酸等;
高分子化合物GPC，GFC分析以及复杂样品纯化;
结论
充分用已知样品结构确定以哪种方法开始
普通反相?离子抑制?离子对?还是其他
观察流动相条件改变时色谱峰的移动
根据变化的方向及大小决定下一步干什么
改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量
色谱柱的改变影响最大
梯度洗脱有利于复杂样品的分离
开发液相色谱方法的考虑因素
分离度是色谱分离中主要考虑的因素
※除分离度之外，在开发色谱方法时，以下几个因素也都要考虑：
灵敏度、载样量、分析速度、溶剂损耗、成本、容易使用、色谱柱寿命、效率
