毛细管电色谱及其在药物分析中的应用（二）

4　研究进展
4.1　柱制备　在CEC中，柱制备是很重要的环节，因为柱性能，如柱重复性、柱寿命、柱效等，是实际应用时最关键、最基础的指标。常用方法是柱内填充固定相颗粒，即填充电色谱柱，主要方式有匀浆填充制备法、拉伸填充制备法、电动填充法。填充柱的柱容量大，但塞子效应、气泡、填充均匀度也是无法回避的问题。近来发展的开管电色谱柱［17,24］和连续床电色谱柱［13,21,23］有望解决这些不足。
4.2　梯度洗脱［15,25,37,38］　Behnke等［37］首次在PEC中利用压力驱动实现了CEC系统溶剂的梯度洗脱，不仅大大缩短了分析时间，而且分离的柱效和分辨率均有显著提高，因而能达到梯度模式色谱的高选择性和电泳分离的高效性。Yan等［38］利用计算机控制电压系统，对CEC实现了溶剂的梯度洗脱，可避免HPLC梯度洗脱系统的流体脉动和可压缩性，保证实验数据的准确性和可靠性。
4.3　CEC-MS偶联技术［40,41］　通过CEC-MS联用可以充分发挥2种方法的优势，进一步进行定性和定量分析，特别对难以分析的复杂组分有重要意义。1995年，Lord等［40］首先实现了CEC-MS偶联，分离了用其它方法难以分离的染料。最近，Wu［16,17］以及Ding等［18］将CEC与MS联用分析蛋白、肽、DNA等生物大分子，获得较理想结果。
5　在药物分析中的应用
目前CEC主要用于包括多环芳烃在内的芳香族化合物、染料、蛋白、肽、寡聚核苷酸、氨基酸、对映体等，在药物分析中的应用逐渐增加。对于疏水性强的样品或电泳淌度相近的离子化合物、对映体，CEC体现出强大的分离能力，并在分析速度、重现性、检测限、定量方面达到了应用的要求［42］。
5.1　手性分离　CEC进行手性药物对映体拆分主要有3种方式:(1)非手性固定相结合手性添加剂流动相，手性选择作用依靠流动相中添加的手性选择剂产生［3］。(2)手性固定相［3,43～46］,固定相上键合手性选择剂，如环糊精、蛋白等。(3)手性分子烙印固定相［12,19］，进行记忆性、专一性手性分离。Mayer等［46］在50 μm开管柱内壁涂布键合了γ-CD或β-CD的二甲基聚硅氧烷，在中性条件下，较好地分离了NSAIDs(布洛芬、氟联苯丙酸、芴丙酸、乙哚乙酸）和1-苯乙醇的对映体。Lelievre等［3］用填充法分别制备3 μm ODS普通电色谱柱和5 μm键合HP-β-CD的硅胶颗粒手性电色谱柱，进行了手性固定相和非手性固定相手性分离的比较，在拆分氯噻酮时，手性固定相方式显示出分离时间短、高选择性和高分辨率的优势。另外，Li等［43］用β-CD手性固定相拆分了环己巴比妥、安息香、脱氧核糖蛋白(DNP)-蛋氨酸、DNP-乙硫氨酸和DNP-正亮氨酸的对映体。Li等［44］用键合α1-酸性糖蛋白的手性固定相电色谱柱分离了环己巴比妥、安息香、戊巴比妥、异环磷酰胺、环磷酰胺、双异丙吡胺、美多心安、心得安、心得平和心得舒，并考察了pH、电解质浓度、有机溶剂浓度对保留和手性选择性的影响。Lloyd等［45］在固定相上键合了人血清白蛋白，拆分了安息香、羟基安定。最近，分子烙印技术已开始引用于手性分离，Schweitz等［19］在毛细管柱内填充含有功能性单体、交联剂、烙印分子(如R-心得安、S-美多心安)的聚合物，使其具有单一的记忆特性，可用于相应手性药物的快速分离，如在120 s内可使心得安、美多心安对映体达到基线分离。
5.2　复杂成分分析　复杂成分分析，特别是分子结构相近或电泳淌度接近的混合成分的分离是比较困难，也是非常重要的。近年来CEC在这方面展示了良好的应用前景，Taylor等［15］利用梯度洗脱电色谱较好地分析了生物体液中皮质醇类化合物，在加电压的同时施加1.2 MPa气压，实施加压电色谱并梯度洗脱，生物体液中肾上腺甾酮、氢化可的松、地塞米松、氟考龙等能在较短时间内很好地分离，当样品预处理后，连续进样200次都能获得良好的分析结果。同样地，Taylor等［33］利用梯度洗脱电色谱结合电喷雾离子质谱检测，分离了苯二氮类(安定、硝基安定)、皮质醇类(去炎松、氢化可的松、泼尼松、可的松、甲强龙、倍他米松、地塞米松、肾上腺甾酮、氟考龙、丙米松)和噻嗪类利尿剂(甲苯喹唑酮、氟硫噻嗪、双氢氟噻嗪、苄氟噻嗪、甲氯噻嗪)等药物。
Smith等［9,11］先用ODS反相电色谱柱分析了甾类化合物Fluticasone propionate及其含有的杂质，在提高流动相pH和有机溶剂乙腈浓度后，分析时间明显缩短，并在相近的条件下分析了前列腺素以及合成的中间体和其它杂质，还较好地分离了头孢氨呋肟的非对映异构体。为了更好地分离强极性或带电组分，达到快速高效，用强阳离子交换树脂替代ODS填料，对三环类抗抑郁剂(丙咪嗪、阿米替林、去甲丙咪嗪、去甲替林、甲吡咯嗪、氯丙嗪、苄氟噻嗪)进行分析，获得8×106.m-1理论塔板数，并有效地改善了峰形。Eimer等［47］采用加压电色谱，15 min内分离了抗癫痫药物及其代谢物(ethosuccinimid、扑痫酮、环氧卡马西平、10,11-二羟卡马西平、苯妥英、卡马西平)，10 min内分离了β-受体激动剂(特布他林、酚丙喘宁、克喘素)，还考察了电压、附加压力大小对分离效率和保留时间的影响。作者认为，在加压下可以降低流动相pH，不需要过多考虑电渗流的损失。Euerby等［42］全面考察了电色谱系统的电压、温控、样品进样量、有机溶剂等因素对药物分析的影响，较好地分离了tipredane的非对映异构体，并有很好的重现性，可以达到定量分析的要求。
最近，Lord等［48］采用梯度电色谱柱结合电喷雾离子质谱检测，分析了异羟洋地黄毒苷元、羟基洋地黄毒苷元、华蟾蜍它灵、洋地黄毒苷元、华蟾蜍精、蟾蜍灵等甾类化合物。魏伟等［27］用离子交换电色谱分离盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸小檗碱等生物碱类成分，斑允东［49］尝试用CEC分离中药复杂成分人参皂苷，开始了CEC在中药复杂成分分析中的应用研究。
6　前景展望
80年代以来，HPLC和CE已在分析领域发挥了很大作用，而同时具备HPLC和CE两者优势的CEC，随着其分离机制的不断探索，柱制备技术的研究和完善，各种分离模式的发展，新型专用电色谱仪器的研制，可充分发挥CEC高效快速［50］、选择性强、稳定性好［51］、灵敏度高、样品用量小、流动相消耗少和自动化的优点。通过CEC-MS联用，CEC梯度洗脱，CEC配合DAD、LIF等检测技术，相信CEC作为一种强有力的新兴分析手段，必将在药物分析，特别是在蛋白、多肽类［52,23］药物和中药复杂成分的定性和定量分析中发挥很大作用。
作者单位：中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心　大连　116011
参考文献