多肽的合成与应用进展（二）
施陶丁格连接方法(图5)是以叠氮反应为基础,以C端的膦硫酯和N端的叠氮化合物反应生成酰胺膦盐,酰胺膦盐水解得到多肽和膦氧化物。
正交化学连接方法是改进的施陶丁格连接方法,通过简化膦硫酯辅助基来提高片段间的缩合率。1.4 组合化学法[20~25]
组合化学法是20世纪80年代在固相多肽合成的基础上发展起来的。它将氨基酸的构建单元按某种组合方式连接起来,合成出包含大量化合物的化学库,并从中筛选出具有某种物理、化学或药理活性化合物的一套合成策略和筛选方案。与传统合成方法不同的是,传统合成方法一次只合成一种化合物,而组合化学法可同时合成多种化合物。常用的合成策略方法主要有:混合-均分法、迭代法、光控定位组合库法、茶叶袋法[21]等。Dubs等[25]利用化学选择平行方法,得到了含有102种两亲性黑色素细胞刺激素(R-MSH)的类似物的肽库。经药理测试发现,其中84种化合物的AMPs的诱导性高于已应用的R-MSH促效剂Melitane。
组合化学法能最大限度地筛选各种新化合物及其异构体,从而首先找到具有药效作用的先导物,是世界各大医药公司普遍采用的方法。目前面临的问题是:如何提高合成化合物组合库的分子多样性和开发与之配套的敏感有效的快速分析和鉴定手段。
1.5 酶解法[26,27]
用酶解法合成多肽,又称酶法多肽,就是用生物酶降解蛋白质,将动植物大分子蛋白质降解成小分子活性多肽。酶解蛋白质所用的酶,大多数是肽酶类。近年来,人们运用酸、碱降解蛋白质获得多肽收获甚微,固定投资大,周期长,污染严重,风险大,未能实现工业化生产。武汉九生堂的邹远东教授利用酶解法开发出大豆多肽、大豆寡肽、鲍鱼肽[26]、海参肽、苦瓜肽[27]、鱼翅肽、燕窝肽等一系列多肽产品,在酶法多肽方面做出了杰出贡献。酶法多肽具有以下优点:酶解不降低蛋白质的营养价值,可获得比原食品蛋白质更多的功能;可保持多肽营养纯天然绿色属性,不含任何化学物质等。但酶解得到的是一系列多肽,分离纯化难度较大,因此不适于合成单一的多肽。另外,肽酶的催化具有专一性,因此,寻找合适的肽酶也是该方法的一个难点。
1.6 基因工程法[28]
DNA重组技术的诞生为合成序列确定的多肽奠定了基础,即可通过设计合适的DNA模板来控制多肽的序列。利用DNA重组技术,可以通过重组DNA产生的工程菌来大量高效地合成多种生物活性多肽。Urry等在大肠杆菌中表达了似弹性蛋白--聚缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-缬氨酸-甘氨酸肽(VPGVG),是基因工程技术应用于多肽合成的范例。利用基因工程技术生产的活性多肽还有肽类抗生素[28]、干扰素类、白介素类、生长因子类、肿瘤坏死因子、人生长激素、凝血因子、促红细胞生成素、组织非蛋白纤溶酶原等。基因工程法合成多肽具有表达定向性强、产品安全卫生、原料来源广泛和成本低等优点,可以得到质量高、疗效好且具有天然活性的多肽类药物,但存在高效表达等技术难题,分离困难,产率低,成本昂贵,难以用于规模生产。
1.7 发酵法[29]
发酵法是从培养的微生物产生的代谢产物中提取多肽的方法。目前,微生物能够独立合成的聚氨基酸只有E-聚赖氨酸(E-PL)、C-聚谷氨酸(C-PGA)和聚(L-精氨酸-L-天冬氨酸)(蓝细菌肽)。发酵法的优点是工业化成本低,但是产物范围窄,且产物提纯复杂。
2 多肽的应用
目前,多肽的应用主要集中在多肽药物、多肽药物载体、组织工程材料和多肽营养食品等方面。
2.1 多肽药物[30~35]
除了传统的多肽类激素外,对多肽类药物的开发已经发展到疾病防治的各个领域:多肽疫苗可用于SARS病毒[31]、肝炎、艾滋病等病毒性传染病的预防;与肿瘤基因靶点特异结合的多肽可用于治疗肿瘤[32~34];从肽库内筛选细胞因子模拟肽;多个抗菌肽可杀死肿瘤细胞;天然植物中分离出的一些小肽可治疗心血管疾病等。此外,在诊断试剂中多肽的用途主要是用作抗原检测寄生虫的抗体,多肽抗原比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强,也易于制备,且易于临床应用。
2.2 多肽药物载体[36,37]
多肽用作药物载体,既可以用作药物载体的修饰剂,也可以作为药物载体的主要组成部分。Law等[36]设计了蛋白酶断裂点连接的肽段在合适的溶剂中自组装后将药物包覆在微球内,遇到靶向蛋白酶使得断裂点断开,实现药物的靶向释放,如图6所示。
彭师奇等将精氨酸-甘氨酸-天氨酸-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)四肽修饰脂质体用作药物载体导向溶栓。运用血小板的纤维蛋白原(FG)受体配基RGDS肽作为导向归巢装置,偶联于包裹尿激素UK的脂质体。载体与药物之间以酸敏感性共价键的形式连接,在自然界或人体内能生物降解成内源性物质Glu,不易产生积蓄和毒副作用。
2.3 组织工程材料[38,39]
一些不具有生物活性的高分子多肽,如聚天冬氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酸等,由于具有良好的生物相容性、可控生物降解速率、可修饰性、设计的可塑性、结构的可控性等优点,逐渐成为组织工程中极具应用前景的一类新型材料。Langer等制备了聚(乳酸-赖氨酸),将RGD肽接枝到聚合物中赖氨酸的-NH2上,有效提高了聚合物表面的细胞粘附能力,克服了主链无活性基团的不足,获得的组织工程支架材料既便于细胞识别,又能支持细胞生长[39]。
2.4 多肽营养食品[40]
活性肽类食品作为一种新型保健食品,具有独到的特性和功能,在营养学上也有着许多优点,在食品工业中具有广阔的应用前景。根据来源不同,活性肽营养食品主要有以下几类:乳蛋白肽类制品、植物肽类制品、胶原肽类制品、畜产类和水产类多肽制品等。
