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Ultivo三重四极杆液质联用对氯沙坦钾中NMBA 进行定量分析

2021.3.16

　　：本文介绍了采用 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统检测氯沙坦钾中的亚硝胺类杂质 N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸 (NMBA) 的方法。该方法采用常规 ESI 源，即可获得满足检测要求的分析结果，且方法简单、特异性高、灵敏度可达 0.005 ppm，大大优于 FDA公布的限量要求，非常适用于对氯沙坦钾类产品中的 NMBA 进行快速、准确的定量分析。

　　前言：2019 年 3 月 1 日，美国食品药品监督管理局 (FDA) 在[1] 发布公告，对用于治疗高血压和心力衰竭的多种通用血管紧张素 II 受体阻滞剂 (ARB) 药品自愿召回。导致此次召回的主要原因是发现其中含有 NMBA 杂质，这是在 ARB 药物中检测到的第三种亚硝胺类遗传毒性杂质。 NMBA 全称 N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸 (N-nitroso-N-methyl-4-aminobutyricacid，CAS 号 61445-55-4），结构如图 1 所示，属于亚硝胺类遗传毒性杂质。根据 FDA 初步评估， NMBA 暴露患者的癌症风险增加似乎与 N-亚硝基二jia胺 (NDMA) 暴露相同，但低于 N-亚硝基二乙胺 (NDEA) 暴露的风险。FDA 目前给出的 NMBA 可接受限量是 96 ng/天，在 ARB 药物中临时限度为 0.96 ppm[1]。

　　关于氯沙坦钾中 NMBA 的检测，欧洲 OMCL 实验室 2019 年 4 月公布了 LC-MS/MS（APCI 源）方法[2]，FDA 于同年六月份公布了 LC-HRMS 方法和 RapidFire-MS/MS 方法[3,4]，而 FDA 这两种方法都不是实验室常规的定量分析平台。本文采用配置了 ESI 源的 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统进行 NMBA 检测。该方法操作简单、灵敏度高、特异性高且重现性好，可有效地应用于氯沙坦钾中 NMBA 的定量分析。

　　实验部分：试剂和样品甲醇为质谱级，甲酸为色谱级，购于 Merck；所用实验用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水；NMBA 标准品和样品由合作用户提供。仪器和设备采用 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱系统与 Ultivo 三重四极杆液质联用系统。液相色谱系统配备如下：二元泵（部件号 G7120A）、自动进样器（部件号 G7167B）、柱温箱（部件号 G7116B）。色谱柱选用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件号 695775-902）。另据用户验证，Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C8（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件号 695775-906）也可以达到相似的效果。标准溶液制备精确称取 NMBA 标准品，加水超声溶解，并定量稀释制成每 1 mL 中含 1 mg 目标化合物的高浓度标准品溶液。用水逐级稀释成每 1 mL 中分别包含 0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100 ng 目标化合物的溶液，作为标准品线性系列溶液。线性范围和相关浓度点可根据检测需要自行调整样品前处理取氯沙坦钾样品约 10 mg，加 1 mL 水，摇匀，超声溶解。

　　液相色谱条件：色谱柱： Poroshell 120 EC-C18, 2.1 × 100 mm, 2.7 μm 流速： 0.4 mL/min 柱温： 35 °C 流动相： A) 含 0.1% 甲酸的水溶液 B) 甲醇梯度程序：时间 (min) B (%) 0.00 5.00 0.50 5.00 2.50 20.00 3.00 98.00 6.00 98.00 6.10 5.00 7.00 5.00 后运行时间： 1 min

　　结果与讨论：色谱分离结果氯沙坦钾原料药体系相对简单，可采用常规反相色谱体系（C18 或 C8 柱）进行分离。初始高比例水相主要用于洗脱钾盐，避免高浓度盐的离子抑制效应影响回收率。在本研究中所用的色谱条件下，NMBA 的保留时间约为 2.3 分钟。随后的高比例有机相用于洗脱氯沙坦。由于氯沙坦浓度很高，为避免污染质谱系统，建议将流路设置为“引入废液”。因为受限制的 N-N 键存在顺反结构 (syn and anti conformers)[5]， NMBA 在色谱体系中表现为双峰，本研究中所用的色谱条件可以实现两种异构体的基线分离（图 2）。不过，在 NMBA 定量分析中，需要对两个峰积分并合并峰面积[3]。

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