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高速离心机分离的几种方法

2021.7.09

　　制备型超高速离心机的几种分离方法：

　　A.差速离心：逐次增加离心力，每次可沉降样品溶液中的一些组份。

　　差速离心是一种最常用的方法。在这种方法中，离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在一定速度下一定时间的离心后，就可得到两个部份：沉淀和上清液。

　　通常在第一次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到的上清液以更高速度离心，把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心，直到达到所需要的分离纯度为止。

　　差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。

　　B.密度梯度离心法：可以同时使样品中几个或全部组份分离，具有很好的分辨率。

　　1)速率区带法(rate zonal)：

　　根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步骤如下：

　　在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加(正梯度)。

　　将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。

　　由于不同大小的粒子在离心力作用下，在梯度中移动的速度不一样，所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。

　　注意：样品粒子的密度必须大于梯度液注中任一点的密度。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。

　　2)等密度离心法(isopycnic)：

　　根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。

　　密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它们的平衡点。注意：平衡后粒子的分离完全由其密度决定，与时间无关，此时再改变离心转速，只能改变区带的相对位置。 2.密度梯度分析法

　　1)梯度介质性质与选择：

　　A、应具备的性质：

　　梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求，一个理想的密度材料标准它应是：

　　· 所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围。

　　· 具有某些性质，如折射率，据此可测定它的浓度。

　　· 所形成的溶液粘度低。

　　· 不损伤所分离的样品。

　　· 离心分离后容易除去。

　　· 不妨碍分离积分的分析。

　　B、常用介质种类：

　　表一、常用梯度材料在20℃密度

　　B.梯度介质应用范围：

　　表二、等密度梯度介质的应用

　　+++很好 ++好 +可以 --不适用

　　表三、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度

　　(2)、梯度溶液的准备：

　　计算

　　稀释(本文第三章第一部分)

　　(3)、梯度形状

　　梯度形状分：线型、等速型、阶梯型、平坦型、陡峭型指数梯度。(如下图)

　　梯度形状对于分离是否成功非常重要：

　　最常用的是线型梯度，适用于分离蛋白质、酶、激素、核糖体亚基和一些植物病毒；等速型适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品；不连续或阶梯型梯度最适用于分离整细胞、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒。等速梯度以及长液柱可增进分离能力，适用于分离核糖体亚基、多核糖体及植物病毒。

　　B.梯度柱制备：

　　梯度液柱可以用手工或梯度仪制备

　　半注法：

　　为缩减离心时间，或分离样品较少可用半注法：下半管铺置梯度介质，中间加样品，上面铺Buffer或液体石腊油。

　　(4)、加样方法与加样量：

　　将样品加到梯度液柱上，针尖和离心管成45-60°角度，慢慢地将样品沿管壁流到液面上去，对于DNA一类易断的脆弱样品，应该用孔径较大的移液管代替针头，以避免剪切力对样品的切割作用。样品浓度是梯度柱最小密度的1/10(W/W)。

　　(5)、转子的选择与效应：

　　(6)、分离区带的回收及检测

　　离心后所形成的区带样品的回收方法基本有四种：

　　a.穿刺法

　　穿刺离心管底部，使梯度溶液滴出，将一具有合适阀门的盖帽放在离心管顶，可控制滴出速度。

　　b.虹吸法：

　　将一毛细管轻轻插入管底，尽量防止梯度抖动，用微量泵逐渐滴取，以一定量滴数或体积部分收取。

　　c.加压法：

　　通过一针管将高密度的液体泵入到梯度离心管的底部，部分收集换出的溶液。

　　d.切割法：

　　采用专用的切割刀切割所需区带。

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　　区带检测：

　　所谓区带检测，实际上是对水平转子或角转子和垂直转子离心管中的分离物质所做的监测，通常只是测量在260或280mm时长的吸收值，以决定梯度中的核酸或蛋白的整个分布，这个操作通常称之为在线(on line)监测。

　　如何正确维护你的离心机

　　离心机的发展离心机是将样品进行分离的仪器，广泛应用于生物医学、石油化工、农业、食品卫生等领域。离心机自问世以来，历经低速、调整、超速的变迁，其进展主要体现在离心设备和离心技术两方面，二者相辅相成。从转速看，台式离心机基本属于低速、高速离心机的范畴，通用台式离心机的发展已经模糊了低速、高速、微量和大容量离心机的界线，众多的转头为科研人员提供相当广泛的应用范围，成为科研实验室首选机型。

　　离心机原理

　　利用离心力，根据混合物中各组分沉降系数、质量、密度等的不同原理，将样品混合物中的液体与固体颗粒或液体与液体分离出来。

　　离心机分类

　　离心机是实验室极常见的分离仪器按转速可分为低速离心机、高速离心机、超速离心机等；

　　常速离心机：转速小于3500r/min

　　高速离心机：转速在3500 r/min ~50000 r/min之间

　　超高速离心机：转速大于50000 r/min。

　　按温度可分为冷冻离心机、常温离心机；

　　按容量可分为微量离心机、大容量离心机、超大容量离心机；

　　按外型可分为台式离心机、落地式离心机。

　　使用守则

　　使用离心机首重安全，离心力失控可能造成很大的破坏。因此要注意离心管是否平衡，转速是否超过设置，转子是否有腐蚀等。

　　离心机使用起来看似简单，没有技术含量，但是正确的使用及维护还是很有必要，一旦发生故障，对实验造成延误，也是得不偿失。

　　一. 离心机在预冷状态时，离心机盖必须关闭，离心结束后取出的转头要倒置于实验台上，擦干腔内余水，此时离心机盖处于打开状态。

　　二. 转头在预冷时转头盖可摆放在离心机的平台上，或摆放在实验台上，千万不可不拧紧浮放在转头上，因为一旦误启动，转头盖就会飞出，造成事故！

　　三. 转头盖在拧紧后一定要用手指触摸转头与转盖之间有无缝隙，如有缝隙要拧开重新拧紧，直至确认无缝隙方可启动离心机。

　　四. 在离心过程中，操作人员不得离开离心机室，一旦发生异常情况操作人员不能关电源（POWER），要按STOP。在预冷前要填写好离心机使用记录。

　　五. 不得使用伪劣的离心使管，不得用老化、变形、有裂纹的离心管。

　　六. 在节假日和晚间最后一个使用离心机须例行安全检查后方能离去。

　　七. 在仪器使用过程中发生机器故障，部件损坏情况时要及时与生产厂家联系

　　使用注意

　　实验室常用的是电动离心机电动离心机转动速度快，要注意安全，特别要防止在离心机运转期间，因不平衡或试管垫老化，而使离心机边工作边移动，以致从实验台上掉下来，或因盖子未盖，离心管因振动而破裂后，玻璃碎片旋转飞出，造成事故。因此使用离心机时，必须注意以下操作。

　　（1）离心机套管底部要垫棉花或试管垫。

　　（2）电动离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。

　　（3）离心管必须对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。

　　（4）启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。

　　（5）分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。

　　（6）离心时间一般1～2分钟，在此期间，实验者不得离开去做别的事。

　　电动使用注意问题

　　在企业或院校研究机构中，转速在3000转左右的低速实验离心机已经比较常用，如315型过滤+沉降一体式实验离心机，100型实验离心机，200型实验离心机等。这些离心机设计合理，重心低，安全稳定，在化工、食品、医疗等领域的前期试样分析中得到了更大的应用。

　　操作方法

　　1、使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。

　　2、若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

　　3、离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。

　　4、每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。

　　5、装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。

　　日常保养

　　转子

　　离心机运转前应先切断电源并先松开离心机刹车，可以手试转动转鼓，看有无咬煞情况。

　　检查其他部位有无松动及不正常情况。

　　接通电源依顺时针方向开车启动（通常从静止状态到正常运转约需40-60秒左右）。

　　通常每台设备到厂后均须空车运转3小时左右，无异常情况即可工作。

　　物料尽可能要放置均匀。

　　必须专人操作，容量不得超过额定量。

　　严禁机器超速运转，以免影响机器使用寿命。

　　机器开动后，若有异常情况必须停车检查，必要时需予以拆洗修理。

　　离心机工作时是高速运转，因此切不可用身体触及其转鼓，以防意外。

　　滤布的目数应根据所分离物料的固相颗粒的大小而定，否则影响分离效果。另外滤布安装时应将滤布