荧光酶免疫分析筛选方法检测沙门氏菌的实验过程

一、实验准备  

以下试剂都必须在开始分析之前准备好。

①PBS 吐温溶液。

②对照抗原  移取3mLPBS-吐温溶液放于阳性对照瓶中,充分混合。这些溶液分别为复原的阴性和阳性对照抗原。

③酶接合剂10mL(1瓶)接合剂稀释液于接合剂瓶中,混合并使其在室温下再水化。

④终止液不需要复原。如果出现结晶可在35℃加温溶解。

二、酶免疫检测
①FS法

a.接通荧光计和打印机电源,至少预热1h。

b.从铝箔袋中取出所需数量的微孔测试板每个食品样品一个孔,另加4个孔做对照用。将板稳固地卡入托架中。各移取100μL 阴性对照抗原于A-1,A-2和A-3的每个孔中。移取100μL 阳性对照抗原于A-4中。移取每100μL 加热的M肉汤样品于单独的孔中。在所提供的记录纸上记录样品的位置。

c.将托架置于20～25℃培养60min。

d.培养后,从孔中吸出样品,用洗板器/移液器加300uL PBS-吐温溶液于每个孔中(a)重复此步骤4次以上。(b)吸出最后一次冲洗液。反转托架,在吸水纸上用力拍打托架几次以除去最后的残液。

e.加100uL酶接合剂于每个孔穴的底部,于20～25℃培养40min。

f.在培养期间,制备酶底物,加1片4-MUP 酶底物于5.2mL底物稀释剂甲。解1片酶底物可供两个微量板使用,不时地旋摇至酶底物溶解。

g.重复步骤d(a)和d(b)。

h.加200L4-MUP酶底物于每个孔杯的底部,于20～25℃培养20min。

i.加50μL终止液于每个孔杯内。

②ME,VI和VR法

a.接通读数器和打印机电源,至少预热15min。

b.按①b进行。

c.将托架于35℃培养25min。

d.将加水复原的酶接合剂于35℃预热。

e.在培养期间,制备酶底物,加一片 PMP 酶底物于5.2mL 酶底物稀释液中溶解一片酶底物可供2个微量测试条使用。将酶底物于35℃预热,不时地旋摇溶液至酶底物片溶解。

f.按步骤①d进行。

g.加100μL 复水的酶接合剂于每个孔的底部,于35℃培养20min。

h.重复步骤①d(a)和d(b)。

i.加200uL PMP酶底物于每个孔的底部,于35℃培养15min。

j.加50μL 终止液于每个孔中。

三、读数
①FS检测  将托架放在读数器上,读取每个对照和样品孔的相对荧光单位(RFU)计算3个阴性对照孔的RFU平均值。单个阴性对照值应是≥RFU 平均值和≤1.15RFU 平均值。如果有一个值在此范围外,弃去那个值并重新计算;如果有2个值在此范围外,实验则无效,必须重做。用2.3乘有效的阴性对照的平均值即得出临界值(cut off value)任何样品的值等于或大于临界值时,即为有效反应。

如果阴性对照值的平均值超过1600RFU,临界值就会超出读数范围,实验则无效。冲洗不彻底以及酶底物变质都会使阴性对照出现较高的值。

②ME检测  将托架放于读数器上,读取在550nm 处对照和样品孔的吸收值。计算3个阴性对照孔的吸收值的平均值(X)。单个阴性对照值应是≥0.85X和≤1.15X。如果有1个值在此范围外,弃去那个值并重新计算平均值;如果有2个值在此范围外,实验则无效必须重做。用1.6乘有效的阴性对照值的平均值,即得到临界值。任何一个样品的值等于或大于临界值即判断为阴性。

③检测将孔中的颜色与比色卡的颜色进行比较。将与两个阴性范围的颜色相同的任一孔判断为无反应;具有与阳性范围类似颜色的任一孔判断为有反应。

④VR法从每一检测孔中移取200L,至清洁的微量板的孔中。除用1.65乘有效的阴性对照值的平均值得到临界值外,均按②ME 检测进行。

(9)EA阳性样品的确证EIA检视的阳性表明可能存有沙门氏菌。然而,由于抗体可能与一些其他细菌发生交叉反应,故应进行确证试验。按常规培养方法从四硫磺酸盐肉汤和M肉汤管接种划线于 HE,XLD和BS平板,对培养后平板上的典型或可疑菌落按AOAC967.26C,967.27,967.28进行鉴定。