关于PCR，你知道多少？（三）
PCR反应中引物起着很重要的作用。模板的不同、欲扩增的片段不同、需要的片段长度不同或者是用途不同等等，对引物的要求是不一样的。PCR作为一种体外酶促反应，其效率和特异性主要取决于两个方面，一是引物和模板结合的特异性，二是多聚酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。引物设计的原则一般遵循下列几项：
1、引物的长度以15～30bp为宜。引物过短会使特异性降低，过长则成本增加，而且也会降低特异性。常用的是18-27 bp，但不应大于38，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2、引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C的含量在45～55%之间比较适宜，另外上下游引物的GC含量不宜差别过大。
3、引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在。二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。。
4、引物的碱基顺序不应与非扩增区有较高的同源性，减少非特异性扩增的产生。
5、引物3’末端碱基注意事项：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。另外引物3’末端的末位碱基在很大程度上影响着酶的延伸效率。有资料表明，引物3’末端碱基在错误配对时不同碱基的引发率存在很大的差异。当末位碱基是A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，而在末尾碱基是T时，错配时引发效率大大降低。引物3’末端zui好不要选A.
6、引物5’末端碱基选择注意事项：引物5’末端碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，5’端碱基可以不与模板DNA配对而成游离状态。引物设计时可以在5’末端加上限制性内切酶位点或其他短的序列，可加启动子ATG，可加错配碱基引起突变。文献中报道，在引物5’末端加入10个游离的碱基并不影响PCR反应的进行。
目前较为常用的引物设计软件有：Primer Premier 5.0、Oligo 6.
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