检测自身免疫抗体的蛋白质芯片技术介绍（二）

芯片技术

多路复用蛋白质分析技术最近研制成功，主要包括两种子技术：平板芯片和球形芯片。

平板芯片：该技术采用一块二维微芯片，芯片内含针对各种分析所定义的反应位点。通过可溶阶段的配合基，平板芯片可以对蛋白质、代谢物及其他分子组成的混合物中的几种固定化蛋白进行同时检测。

几年前，某研究小组制造了一种内置1152个反应位点的自身抗原芯片。这种平板芯片采用聚左旋赖氨酸包被的玻璃载玻片作为固体载体。将196种不同的假定自身抗原以4个或8个复制组的形式进行点样，由此产生有序阵列。结合在固体基质上的蛋白质包括36种重组或纯化蛋白质、6种核酸抗原以及154种重叠和免疫显性合成肽，这些肽来自于核内小分子核糖核蛋白、Sm抗原蛋白、多聚（二磷酸腺苷-核糖）聚合酶以及H1、H2A、H3和H4组蛋白。在芯片内可进行针对磷酸化激活修饰蛋白的抗体试验。通常以荧光素Cy3标记的羊抗人IgG作为芯片试验的标记物。

试验可以检测出纳克/毫升浓度水平的抗体，而且线性范围达三个对数。分析灵敏度一般高于酶联免疫吸附分析法(ELISA)。

此项研究所暴露出的一个技术问题是，几种Sm抗原和组蛋白因点样技术被灭活了。据推测，蛋白与固体表面的结合是抗原表位丢失的原因。研究人员表示，或许可以通过优化结合化学性质或者改进表面包被技术来纠正这一问题。此外，一些结合在载玻片上的抗原还受到蒸发速度过快的不利影响。

另一组研究人员也进行了一项试验，他们把14种自身抗原复本以及空白对照和校准品点样在聚苯乙烯孔中（图1），然后将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与可激活的化学发光底物同时使用，并且通过以电荷耦合器件（CCD）摄像机为基础的芯片检测仪记录到了光信号。通过人IgG校准品进行抗体定量。该技术将最常用的临床试验整合在一块简单的微型芯片上。就分析结果而言，这种塑料芯片与商用分析试剂盒不相上下。

作为临床试验室和生物医学研究的专用自动化平台，Randox Evidence采用了蛋白质生物芯片技术，通过CCD摄像机对化学发光反应产生的发射光进行探测。

球形芯片：多路复用蛋白质分析技术的第二种子技术采用了一种微球装置悬浮液，每个装置代表了一种不同的分析试验。该系统有时被称为液体芯片。通过荧光染料对这种微球（直径约5微米的塑料小球）进行内部编码，并分别用于多路复用分析的具体试验。通过流式荧光分光光度法对小球进行检测。

对微球悬浮液进行自身免疫多路复用分析通常采用Luminex公司（美国德州，Austin）开发的技术。通过该公司的xMAP技术，经荧光团编码的微球在不同的分析中起到条形码的作用。⁶　每个小球装置可以通过具有不同生物测定特异性的试剂进行包被，分析物由小球装置中的不同红光和近红外线荧光染料浓度确定。这样就可以对样品中的特定分析物进行捕捉和检测（图2）。分析仪通过一道激光束激活小球的内部染料（这种染料将微球分为不同类别），而另一道激光则激活报告染料（通常是B-藻红蛋白），测定过程中该激发光将被捕捉。各小球装置可以获得几十个到几百个读数。

Luminex 100流式设备通过数字信号处理技术按照预先设定的分布区域对各个微球进行分类。每个微球表面都含有多个羧基，这些羧基可以作为蛋白质共价连接的位点。通过一系列校准品对小球表面的报告染料进行定量测定。

微球具有较小的体积和较大的表面积，比平面固相芯片具有更好的反应动力学性能。而且，微球在悬浮液中的流动性也优于静态平板芯片。将样品均匀分布到所有平板芯片区域极为关键，但是对于悬浮芯片这一点却无关紧要。

目前已有多篇利用Luminex技术进行自身免疫研究的研究报道。其中一个试验同时检测了5种可提取性核自身抗原，与公认的单一试验ELISA法相比具有良好的相关性。另一个小组研究了37名干燥综合症患者血清中的抗核抗原(ANAs)和可提取性核抗原。他们分别在84%和76%的患者血清中检测到干燥综合症A抗原和B抗原(SSA和SSB)的抗体。

Bio-Rad　Laboratories公司(美国加州，Hercules)的BioPlex 2200 ANA筛查仪是一种以Luminex为基础的全自动系统，可以同时测定13种自身免疫抗体的水平。一项临床研究表明，这种ANA筛查仪的特异性与ELISA ANA筛查试验不相上下。　与ELISA试验相似，该BioPlex系统的阳性率低于用于自身抗体筛查的间接免疫荧光试验。

优点和缺点：这两种多路复用技术（悬浮和平板芯片）各有优缺。二维微芯片技术在蛋白质或核酸的高密度筛查（包括100多种的试验）方面非常出色。平板芯片尤其适用于单一试验中对从细菌到人的各种生物体的整个基因组或蛋白质组进行同时分析。微球芯片在临床试验室中的优势尤为突出，这些试验中的检测分析物都是精心设定而且通过较小的面板进行测定。

微芯片技术有时缺乏高通量临床应用所必需的重复性。这主要是因为平板芯片的制备需要序列化的生产过程。相反，微球芯片的大量生产具有平板芯片不易达到的分析重复性。

此外，平板芯片的超静定性和统计检验水平也不如微球芯片。这是因为每个测定装置在一次多路复用小球反应中通常会检测数百个微球，每个小球代表一种不同的免疫测定，而且在计算结果前即可将数据集中的异常值排除在外。

悬浮芯片有助于根据客户要求将配合基与每个小球装置进行偶合。结合在不同小球装置上的配合基可以在不同结合化学性质和反应条件下进行反应。每种配合基的纯度可能各不相同，例如有的像细胞裂解液一样，而有的像重组蛋白一样。每个小球装置与配合基之间可以使用不同的接头。最后，在每个小球装置制造时可以采用不同的包被后或封闭步骤。