四、化学发光信号

4.1 信号捕捉

虽然化学发光蛋白质印迹法十分常用，但是对于难于捕获的信号的捕捉却很棘手。蛋白质印迹法要用到一系列需要技巧的技术，因此许多因素都会导致无法捕捉到信号。由于变量较多 (表 33. 2)，问题印迹的问题诊断和排除就如同大海捞针一样困难。传统的方案在检测某一个蛋白质时通常都是无效的。例如 ， 一 抗可能无法识别变性状态下的固定化抗原。尽管在非变性环境下蛋白质可保持天然状态，但这却使得目标蛋白质分子质量的确定更具挑战。此外，超大型或疏水蛋白质通常会阻碍有效的膜转移。另外，小型蛋白质 (小于等于 10 kDa) 会从膜孔中穿出，无法与膜结合。因此, 为确保能够用于检测靶物质，Towbin 的原始方案一再被修改。这些修改包括使用不同的试剂进行间接检测或 4标记的一抗进行直接检测。有时可以完全跳过转移这一步骤，在凝胶内完成检测（Desaiet al.,2001)。

体 持 续 时 间 取 决 于 所 使 用 的 特 定 底 物 。产 生 了 多 少 光 、这 些 光 能 持 续 多 久 , 则 取 决 于 具 体使 用 的 底 物 以 及 系 统 中 酶 与 底 物 之 间 的 比 例 。尽 管 用 于 一 个 印 迹 的 底 物 量 相 对 恒 定 ，呈现 的 酶 的 数 量 却 和 添 加 量 以 及 其 他 因 素 有 关 (见 表 33.1)。在 蛋 白 质 印 迹 系 统 中 ，酶 联 物过 多 是 导 致 信 号 易 变 、背 景 太 深 、信 号 持 续 时 间 短 及 灵 敏 度 低 的 单 一 的 最 主 要 的 原 因 。

最 理 想 的 信 号 发 射 曲 线 是 缓 慢 衰 减 的 (图 33. 4 ) , 因 为 这 表 明 系 统 中 的 每 一 组 分 都 达到 了 最 优 化 ，并 能 产 生 可 重 复 的 结 果 。信 号 衰 减 的 太 快 会 造 成 差 异 ，使 得 灵 敏 度 低 及 信 号记 录 不 足 。持 续 时 间 长 的 信 号 能 最 大 限 度 减 小 因 转 移 效 率 、底 物 制 造 商 批 次 和 其 他 因 素造 成 的 差 异 。

虽 然 H R P 在 底 物 存 在 的 情 况 下 能 保 持 活 性 ，但 是 随 着 和 底 物 接 触 时 间 的 延 长 , H R P也 会 失 活 。在 氧 化 反 应 中 产 生 的 自 由 基 可 与 H R P 结 合 ，这 种 方 式 让 酶 无 法 再 与 底 物 反应 。系 统 中 过 量 的 H R P 也 会 产 生 大 量 的 自 由 基 ，这增 加 了 H R P 失 活 的 可 能 性 。 自由基还 会 破 坏 抗 原 、抗 体 和 膜 ，降 低 膜 再 标 记 的 有 效 性 。

4.3 蛋 白 廣 印 迹 的 优 化

每 一 个 蛋 白 质 印 迹 系 统 都 必 须 经 过 优 化 以 获 得 一 致 的 实 验 结 果 。许 多 因 素 都 会 影 响信 号 的 强 度 和 持 续 时 间 , 每 一 种 因 素 都 可 被 优 化 , 我 们 将 在 以 下 几 节 中 讨 论 。本 章 末 尾 关于 方 案 的 一 节 包 括 了 优 化 步 骤 的 具 体 指 导 和 建 议 。

4.3.1 印迹膜

膜 组 分 似 乎 不 能 影 响 H R P -鲁 米 诺 反 应 以 及 后 续 的 信 号 产 生 。然 而 ，硝 酸 纤 维 素 膜和 P V D F 膜 的 确 在 蛋 白 质 结 合 特 性 上 有 所 不 同 。一 般 来 说 ，硝 酸 纤 维 素 膜 能 更 好 地 与 蛋白 质 结 合 ，条 带 更 清 晰 ，有 时 候 灵 敏 度 也 更 高 。而 P V D F 膜 疏 水 性 更 强 , 不 易 浸湿 ，有 时会 产 生 更 多 背 景 信 号 ，然 而 ，它 具 有 较 大 的 抗 张 强 度 和 良 好 的 操 纵 特 性 。为 获 得 最 好 的 实验 结 果 ，需 要 根 据 经 验 来 确 定 蛋 白 质 印 迹 系 统 最 优 化 的 膜 类 型 、制 造 商 和 批 次 。一旦 证 明某 种 膜 在 系 统 中 有 效 ，最 好 在 整 个 研 究 过 程 中 都 使 用 这 一 批 次 的 产 品 。

4.3.2 靶蛋白

不 同 蛋 白 质 的 转 移 效 率 有 着 很 大 不 同 。在 特 定 的 设 置 的 条 件 下 ，蛋 白 质 迁 出 凝 胶 的能 力 及 结 合 膜 的 向 有 所 不 同 。转 移 效 率 依 赖 于 一 定 因 素 ，如 凝 胶 组 分 、凝 胶 与 膜 的 接 触程 度 、电 极 的 位 置 、转 移 的 持 续 时 间 、蛋 白 质 大 小 和 组 分 、电 场 强 度 及 是 否 加 人 去 污 剂 。低离 子 强 度 缓 冲 液 和 低 电 流 的 条 件 可 使 大 多 数 蛋 白 质 达 到 最 优 转 移 。使 用 与 免 疫 印 迹 相 兼容 的 或 可 逆 的 染 料 对 膜 进 行 染 色 ，可 评 估 转 移 效 率 (Sasse and Gallagher, 2008)。用 于 膜染 色 的 一 些 常 见 蛋 白 质 染 料 包 括 : 丽 春 红 S ,— 种 可 随 时 间 褪 色 的 红 色 染 料 ; 考 马 斯 染 料 ，一 种 可 紧 密 结 合 蛋 白 质 并 干 扰 免 疫 印 迹 的 敏 感 的 蓝 色 染 料 ,— 种 简 单 可 逆 的 蓝 色 染 料（Antharavally et al. ，2004)。

4.3.3 封闭缓 冲 液

很 多 不 同 的 封 闭 试 剂 都 对 蛋 白 质 印 迹 有 效 。因 为 没 有 任 何 一 种 封 闭 剂 适 用 于 所 有 系统 ，故 有 必 要 进 行 检 验 (Spinola and C a n n o n ，1985)。理 想 的 封 闭 缓 冲 液 具 有 最 大 的 信 噪比 ，而 且 不 会 与 系 统 中 的 抗 体 或 靶 物 质 反 应 。例 如 , 在 亲 和 素 -生 物 素 系 统 中 使 用 5 % 脱脂 牛 奶 作 为 封 闭 剂 可 造 成 高 背 景 ，因 为 牛 奶 中 含 有 不 同 量 的 内 源 生 物 素 , 可 与 亲 和 素 蛋 白结 合 。当 变 换 底 物 、抗 体 或 靶 物 质 时 ，仅 仅 因 为 对 于 这 一 新 系 统 封 闭 缓 冲 液 不 再 是 最 理 想的 , 就 可 能 引 起 信 号 减 弱 或 背 景 增 强 。

在 封 闭 缓 冲 液 中 加 人 表 面 活 性 剂 ，如 去 污 剂 T W e e n -20，可 为 某 些 系 统 带 来 好 处 。表 面 活 性 剂 阻 止 封 闭 试 剂 与 靶 物 质 的 非 特 异 结 合 ，或 将 膜 上 抗 体 可 以 结 合 的 疏 水 位 点 封闭 , 从 而 使 背 景 最 弱 化 。然 而 ，加 入 过 多 的 去 污 剂 会 造 成 封 闭 不 充 分 。通 常 我 们 使 用 终 浓度 为 〇. 0 5 % 的 去 污 剂 。但 是 ，为 了 得 到 最 好 结 果 , 我 们 要 确 定 去 污 剂 是 否 增 强 了 某 个 特殊 系 统 及 确 定 去 污 剂 的 理 想 浓 度 。通 常 使 用 高 质 量 低 污 染 的 去 污 剂 。

4.3.4 抗体

不 只 是 作 用 于 抗 原 的 一 抗 的 亲 和 力 很 重 要 , 一 抗 和 二 抗 浓 度 同 样 对 信 号 强 度 有 很 大影 响 。一 抗 或 /和 二 抗 浓 度 不 当 会 造 成 印 迹 上 H R P 过 多 。采 用 最 小 一 抗 浓 度 比 较 有 利 ，因 为 这 样 能 推 动 靶 物 质 的 特 殊 结 合 并 降 低 背 景 。

如 果 印 迹 不 能 产 生 足 够 的 信 号 ，就 将 所 有 的 检 测 试 剂 从 印 迹 中 移 除 (剥 离），并 使 用 不同 的 一 抗 或 不 同 的 抗 体 浓 度 重 新 标 记 ，这 种 做 法 常 常 可 以 节 约 珍 贵 的 样 品 ，并 且 节 省 时间 ; 然 而 ，不 充 分 的 剥 离 可 使 有 活 性 的 H R P 残 留 在 印 迹 上 并 产 生 信 号 。将 底 物 加 在 被 剥离 的 印 迹 上 , 随 后 便 可 检 测 出 印 迹 上 是 否 残 留 活 性 H R P 。 同 样 , 剥 离 无 法 移 除 的 大 量 失活 H R P 分 子 会 抑 制 一 抗 与 靶 物 质 的 结 合 。剥 离 并 重 新 标 记 印 迹 是 一 种 获 得 特 殊 系 统 相关 信 息 的 有 效 方 法 ，但 并 不 是 一 种 确 定 理 想 系 统 参 数 的 决 定 性 方 式 。

4.3.5 检 测 方 法

习 惯 上 ，使 用 胶 片 来 检 测 蛋 白 质 印 迹 的 化 学 发 光 信 号 。它 不 需 要 昂 贵 的 设 备 ，并 能 提供 极 佳 的 灵 敏 度 ，但 却 只 有 狭 窄 范 围 的 线 性 检 测 强 度 。通 常 需 要 调 整 胶 片 的 曝 光 时 间 以得 到 具 可 出 版 质 量 的 印 迹 结 果 ，这 会 消 耗 时 间 并 造 成 浪 费 。将 曝 光 后 的 胶 片 浸 泡 在Thermo Scientific Reagents 系 列 产 品 中 可 以 移 除 曝 光 过 度 产 生 的 额 外 信 号（图 33.5 ) 。这 些 试 剂 可 以 均 匀 地 移 除 胶 片 中 的 银 ，在 优 化 胶 片 表 观 的 同 时 维 持 信 噪 比 。

C C D 照 相 机 及 附 带 的 分 析 软 件 可 以 调 整 背 景 水 平 并 完 成 密 度 测 定 。与 胶 片 相 比 ，成像 仪 在 检 测 方 面 具 有 一 定 优 势 ，因 其 有 较 大 的 动 态 范 围 和 高 程 度 的 曝 光 控 制 ，可 在 没 有 高背 景 或 高 强 度 信 号 干 扰 数 据 的 情 况 下 尽 可 能 地 完 成 图 像 记 录 。此 外 , 理 想 的 曝 光 时 间 可防 止 条 带 信 号 饱 和 , 并 能 观 察 到 密 度 的 微 小 变 化 。相 比 较 而 言 ，胶 片 具 有 较 小 的 动 态 范围 ，条 带 信 号 也 会 迅 速 达 到 饱 和 。当 信 号 强 度 较 高 时 ，胶 片 的 低 动 态 范 围 使 其 快 速 饱 和 ，并 且 曝 光 控 制 的 局 限 性 通 常 会 产 生 过 度 曝 光 的 图 像 。