选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等等。
基质
基质的性质
基质构成固定相的骨架，亲和层析的基质应该具有以下一些性质：
1.具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的pH、离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改变。
2.能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变基质和配体的基本性质。

3.基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与配体结合。基质的孔径过小会增加基质的排阻效应，使被分离物与配体结合的机率下降，降低亲和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大孔径的基质，以使待分离物有充分的空间与配体结合。
4.基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并与配体作用。
一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它对蛋白质等生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，另外它的稳定性和均一性也较差。交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好，但它们的孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低，不利待分离物与配体充分结合，只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。多孔玻璃珠的特点是机械强度好，化学稳定性好。但它可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。琼脂糖凝胶则基本可以较好的满足上述四个条件，它具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。琼脂糖凝胶微球的商品名为 Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
基质的活化
基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。
多糖基的活化
多糖基质尤其是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。琼脂糖的活化方法很多，下面介绍一些常用的活性基团及活化方法。
1.溴化氰活化
溴化氰活化法是常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。
溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步处理还可以得到很多其它的衍生物。这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。