RT-PCR的操作难点及注意事项

 1.优质RNA的获取

    2.特异性引物设计

    3.TaqMan探针的设计和荧光标记物选择

    4.标准曲线分析

    一般，DNA样品的定量标准品为基因组DNA&质粒，RNA样品的定量标准品为Total RNA&cDNA&体外转录RNA。绘制标准曲线的标准品梯度的选择一般为5——6个梯度，标准品的稀释倍数通常为10。

    5.熔解曲线分析

    SYBR Green I 法进行检测时，可根据熔解曲线确认PCR产物的特异性。曲线横坐标是温度，纵坐标是荧光强度的变化值（不是强度本身）。其原理是依据温度从60度升至90度时，荧光强度的变化值。当温度达到PCR产物的Tm（双链DNA分子解链一半时的温度）时，荧光强度变化最大（峰值）。

    6.绝对定量分析方法

    绝对定量中，LOG（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可制作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系。然后根据样品的Ct值，来确定未知样品的初始模板拷贝数或浓度。通常用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。

    其中，标准品的稀释方法与拷贝数计算如下图所示：

    7.相对定量分析方法

    相对定量用于测定单个样品基因的差异表达分析或者比较两个或两个以上样品中某个基因表达量的变化，则其结果必须用内对照基因（管家基因）校正。管家基因通常指维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH/Actin/18s rRNA等，实际操作中可依据文献或具体实验进行筛选。相对定量的分析方法主要有两种：双标准曲线法和2^-△△Ct法。