基于纳米粒子等离子体共振耦合的细胞中分子组...（三）

我们用高光谱成像来量化与EGFR行为有关的纳米粒子散射变化(图 3, a-i)。高光谱成像要求使用PARISS系统 (Lightform公司)。散射的巅峰在530-550 nm之内的图像采集于4 ?C 条件下(图 3d)：在这种条件下，EGFR明显位于细胞质的膜上。在25 ?C时随着EGFR主要集中在早期胞内体时红色漂移开始增多(图 3e)。然而在37 ?C时宽谱波段的巅峰位置很明显(图 3f)。在4 和 25 ?C(图 3g 和 h)，波峰分布的平均值和标准差分别为546 ±15 和 574 ± 20 nm。有趣的是，在37 ?C (图 3i)散射光谱的波峰有很大程度的偏移（平均值和标准差为597 ±44 nm）；这与细胞内存在EGFR多样机制和交易阶段是一致的。

图3.  绑定金纳米粒子EGFR的散射与EGFR调控阶段之间的定量关系。在4 ?C (左边, a,d,g), 25 ?C (中间, b,e,h), 和 37 ?C (右边, c,f,i)标定细胞的暗场高光谱显微。用图1中描述的显微装置来获取数据。在细胞图像中代表性的单像素光谱显示了在大约 546 (a), 576 (b)和 601 nm (c)散射的波峰。(d-f)图像是根据视场范围内每一个像素的散射波峰位置标定的颜色。如果一个像素没有可以辨认的波峰与光谱相对应的像素，就不给分配颜色。(g-i) 显示了(d-f)中顶峰散射波长的分布。(j-l)为下面三个典型结构是纳米粒子聚合物光谱的电动模拟：一个4-粒子的链状结构(j,m)、一个19-粒子的盘状结构(k,n)，一个130-粒子的卷装结构(l,o)。全部的散射截面都标给每一种结构标绘的，旁边附带相应的粒子分布细节(m-o)。受有效粒子数目增长的影响和从二维到三维的形态变化的作用产生了明显的红色漂移和散射光谱的增宽。

金属纳米粒子聚合物光散射电动模型

为了进一步发掘纳米粒子聚合物形态与联合光学截面之间的关系，我实施详细的电动模拟。用于计算纳米聚合模拟的电动代码是完全应用基于C++的部分新型T矩阵代码，它是在过去的几年中被开发出来的。自始至终都使用混合的多线程的信息通道截面(MPI)工作模型，采用最佳的现代群组计算资源。具体的扩展至聚合物的T-矩阵构架主要基于Mackowski, Mishchenko41-43 和 Stout44探讨的方法。介电常数函数的细节在Aaron et al上有陈述。在所有的实验中入射光都是非偏振的，波动矢量像图 3m-o一样指向页面。金球体直径为25nm，由水环绕，粒子中心间隔为2.4倍粒子半径。粒子的3D理想晶格点分布的小数标准偏差为0.07。每一个聚合形态都用TEM图像中描述的聚合颗粒的数目、颗粒空间、以及整个形态的典型值来构造。

纳米粒子聚合物的光学反应复杂非线性地依赖聚合物的形态细节，而且很大提高光学截面群集粒子数量的变化29,40。聚合物的形态细节可以显示受体/纳米粒子的数量、空间和总体的空间分布（比如二维平面或者三维立体结构）。通常情况粒子间耦合的影响会产生一个红色漂移和谐振波峰的变宽。图3(j-l)显示三种典型结构(图 3m-o)的散射横截面，这三种模型被设计成近似聚合物形态，图2d-f。注意的是模拟光谱显示总体红移和波峰增宽，与图3a-c描述的一致。

对于随机的聚合物，由于在粒子空间内高位非线性地依赖等振粒子共振耦合，所以粒子位置平均值波对光谱漂移有明显影响。而且像那些在胞内体看到的三维volume-filling 比二维聚合物经历着更多的光谱漂移。这是值得关注的，因为它说明NPRC可以探测到形态上面的差别与内化作用有关，这种内化作用是由相应纳米级别EGFR组织的变化导致的。

监视EGFR交易

既然已经建立了绑定纳米粒子的EGFR散射性质与EGFR的调控阶段之间的关系，我们检验三基色图像等级也可以有效地用来监视EGFR交易。活细胞颜色图像的红带相对强度出现增长(图 1, B)是EGFR激活和内吞作用的一个明显标志。因此，我用这个参数将活细胞图像颜色变化与EGFR的控制阶段联系起来。为了达到这个目标，图3提供的高光谱数据被分成三个类别，分别对应相关联的EGFR的调控阶段。（1）表皮受体，（2）早期胞内体，（3）晚期胞内体/MVB。每组至少要分析5个完整的细胞被，每组至少代表1000光谱。用得出的结果光谱被来为每一个EGFR区域标准化红带强度值获得统计上的明显的区域分布（图4）。然后对每一个无背景像素的延时图像，我们分析标准红带值属于每一个相关EGFR阶段的几率。这些成对的比较导致3个假定值，在为活细胞图像每个图像设定伪色时这些假定值被用作权定因数。这个分析可以形成图像，在图像中颜色代表着EGFR控制阶段的统计概率(图 5)。

图4.标定金纳米粒子EGFR分子的相关红带强度分布——细胞表面（蓝）、早期胞内体（绿）、后期胞内体（红）