独体—基于纤连蛋白类型Ⅲ结构域框架的抗体模拟 Akiko ...1

独体—基于纤连蛋白类型Ⅲ结构域框架的抗体模拟 Akiko Koide and Shohei Koide实验

实验材料 pAS38pAS45pAS47

试剂、试剂盒 聚乙二醇（PEG) 氯化钠溶液HEPES 缓冲液涂布溶液Tris 缓冲盐水TBS-Tween-20琼脂糖-磷酸溶液

仪器、耗材 LBSOCYT

实验步骤

3.1 实物库构建

我们用 Kunkel 突变技术构建大多数的实物库虽然我们证明了  AB 链套可用来结合目标分子，但多数情况下，我们用 FNfn10 的 “上” 端（BC、DE 和 FG 链套；图 6.1A ) 作为目标分子结合位点 [ 10 ]。我们的方法基于 Bio-Rad 的 Mutagene kit [17]。用大肠杆菌 SS320 做电转化，可以很容易地制备含有大约 109 个独立克隆的实物库。

3.1.1 尿嘧啶单链噬粒的制备（用于单价噬菌体展示和酵母双杂交筛选)

( 1 ) 用 pAS47、pAS38 ( 用于独体-基因 III ) 或 pYT 45 (用于 B42-独体）转化 CJ236，在 LB- AP 平板中选择菌落。

( 2 ) 把一菌落接种到 2 ml 2X YT-Ap-氯霉素培养基，37°C 摇动过夜。

( 3 ) 将 30 ml 补充了 0.25 μg/ml 尿苷的预热 2X YT-Ap 培养基装入 250 ml 规格带凹陷三角烧瓶，用 300 μl  CJ236 过夜培养液接种，再加入 1010 个/ml 辅助噬菌体 KO7( Promega)。在强力摇动下于 37°C 生长 2h。加入 Km 使终浓度达到 70 μg/ml。在强力摇动下于 37°C 生长过夜。

( 4 ) 于 4°C 以 12000 g 离心 [ 10000 r/min，用 SS-34 (Sorvall) 或等效的转子 ] 10 min。将上清液移入新试管，再次以 12000 g 离心 10 min。将上清液移入新试管。加入 4.5 ml PEG/NaCl 溶液，并彻底混合。4°C 保育过夜。

( 5 ) 于 4°C 以 17200 g 离心（12000 r/min，SS-34 转子）20 min。抛弃上清液将试管倒放在一叠纸巾上 1 min 。用纸巾擦去残余液体。

( 6 ) 将噬粒沉淀悬浮于 1 ml TBS 中，并移入微离心管。在微型离心机上以最大速度离心 2 min。将上清液移入新微离心管。加入 150 μl PEG/NaCl 溶液，彻底混合。在冰上保育 30 min。

( 7 ) 在 4°C 以最大速度离心 10 min。拋弃上清液，稍加离心，并用移液器除去所有液体。将沉淀悬浮于 1 ml TBS 中。

( 8 ) 用 XL-1 Blue 和 CJ236 测定噬粒浓度。将 100 μl 新鲜大肠杆菌（600 nm 光密度 OD 值为 0.5~1.0 ) 和 10 μl 系列稀释噬粒溶液混合。室温保育 15 min，并铺在 LB-Ap 板上。在 37°C 保育过夜。用 CJ236 的滴定值应该是 1012~1014 个/ml，并且应该比用 XL-1 Blue 的值大 104。

( 9 ) 用 Qiagen 单链 DNA 制备试剂盒制备尿嘧啶单链 DNA。

3.1.2 尿嘧啶单链噬菌体的制备（用于多价噬菌体展示载体， JCFN )

( 1 ) 用 JCFN 质粒转染 CJ236。热激之后，与 30 ml 预热的 2 X YT 和 500 μl 新鲜的 CJ236 ( OD600 值  0.5~1.0 ) 混合，再于 37°C 摇动 6 h。

( 2 ) 完成 3.1.1 节的步骤（4 ) 至（9 )。为测定浓度，混合 3 ml  LB 和 0.7% 琼脂糖（熔化后冷却至 45°C )，10 μl 连续稀释的噬粒溶液和 100 μl 新鲜的大肠杆菌。混匀并立即冲入 LB 平板中。在 37°C 培养保育过夜并测定滴度。

3.1.3 突变寡核苷酸的制备

( 1 ) 设计一寡核苷酸，取决于 GC 含量，使其分别含有大约 20 和 15 个碱基的 5' 或 3' 补区。我们使用密码 NNK 和 NNS 来进行 “硬”随机化，其中 N 代表所有核苷酸的等摩尔混合；K 代表 G 和 T 的等摩尔混合；S 代表 G 和 C 的等摩尔混合。

( 2 ) 将约 10 μg 溶解于水的粗寡核苷酸做丙烯酰胺凝胶电泳，切出对应于正确分子质量的带，将寡核苷酸用电洗脱（ 见注 3 )。

( 3 ) 将 2 μg 纯化的寡核苷酸、3 μl T4 多聚核苷酸激酶缓冲液、5U T4 多聚核苷酸激酶（New  England  Biolabs)、1.5 μl 10 mmol/L 腺苷三磷酸混合，加水至 30 μl。37°C 保育 2 h，然后 65°C 保育 15 min。将溶液在一20°C 保存。