荧光原位杂交技术检测植物基因组中整合的转基...（二）

3.2 染色体制备

无论是荧光染色还是 FISH，分裂期和分裂间期的染色体制备均于载物片上进行。

建议使用蛋白水解酶对材料进行预处理，以去除细胞壁和细胞质，再将样品置于载玻片上，滴上乙酸，然后盖上玻片压片。所有操作均于室温下进行，除非是特殊说明。在洗涤和材料准备时使用小培养皿，方法见 2. 2 节。

( 1 ) 用酶缓冲液洗涤植物材料上的固定剂两次，每次 10  min 。

( 2 ) 转移植物材料到 1~2 ml 酶解液中，依据材料的不同在 37℃ 温育 30 min 到 2 h ( 见注 2 ) 。

( 3 ) 将植物材料从酶解液转移至酶缓冲液。

( 4 ) 将 2~3 份材料移至 0.5 ml 45% 的乙酸中，放置几分钟。如果材料太软，此步骤可以省略。

( 5 ) 将载玻片浸泡到 96% 的乙醇中再用无毛布擦干。载玻片上滴一滴 60% 乙酸。

然后将一小块根尖或其他的材料放入乙酸中。可根据需要更换乙酸。

( 6 ) 在解剖镜下，撕开组织或用玻棒轻敲组织并去掉颗粒物。处于分裂期的细胞更易浮起。

( 7 ) 用手纸擦盖玻片后放到玻片上，相差显微镜观察。为获得最适片子，用手( 拇指）压片，用力或轻或重，根据需要。也可敲打盖玻片（译注： 建议用皮头铅笔的橡皮头敲）。

( 8 ) 显微镜下观察细胞密度和分裂中期指数，将比较好的样品放置到金属板上置于干冰中 5~10 min  ( 不要过长时间）。用刺须刀刀尖轻轻挑开盖玻片，然后风干。

( 9 ) 相差显微镜下浏览未封片的玻片。寻找充分分散、不成堆聚集的细胞核，玻片应没有表层膜和杂质。分裂中期染色体应该充分分散，没有细胞质和杂质残渣等。对每张玻片进行记录以优化下次制片过程。小染色体可以通过 DAPI 染色来检测（见 3.7 节)。

( 10 ) 在玻片上划上线以标记样品所在玻片上的位置，因为在其后的步骤中，样品位置在潮湿的玻片上是看不见的。

( 11 ) 玻片于 4℃ 干燥保存数天或者于 -20℃ 保存数月（见注 13)。

3.3 探针标记

因为基于随机引物法或缺口前移原理的相关操作说明在商用试剂盒已有提供，本章不再讲述标记 DNA 的实验操作方案。直接 PCR 标记法也是常用的方法，这种方法是在扩增克隆的特定片段，或扩增总基因组 DNA 的特定片段时，结合引入带标记的分子。

为保证 FISH 的成功，必须在探针中引入比例合适的带标记分子，以便于检测。为使聚合酶作用更有效，带标记的核苷酸（dUTP 或 dCTP ) 与非标记 TTP 或 CTP 按 1 :2 混合。试剂生产商常常提出标记核苷酸的推荐浓度和稀释度，以获得最佳整合效率。这是一个标准实验的起点要求量，不过一些非常昂贵的标记核苷酸，尤其是刚打开的还未经多次冻融的试剂，其用量可以减少至推荐用量的 50%~70%。另一个重要因子是标记后探针的长度。探针不能太长，一般是 200~600 bp，以免不能渗透进染色体的 DNA 中。随机引物法和缺口前移法产生的探针长度恰好适宜于 FISH，不过，有时可能需要对缺口前移酶体系中的 DNA 酶组分加以调整。用 PCR 法标记较大的插入克隆，可能不会得到好的探针。

另一个影响标记成功与否的因素是模板 DNA 的纯度，以及用于加标记的 DNA 模板序列的长度。使用克隆片段时，要确保小量制备的 DNA 是纯净的、未受细菌污染，这样插入片段才能被干净、完整地酶切。对较小的插入片段（100 bp 到 2 kb ) ，推荐使用 M13 测序通用引物进行 PCR 扩增，这样能获得非常纯净的模板 DNA。在用随机引物法或切口前移法进行标记前，最好将 PCR 产物经电泳后割胶回收目的条带，以纯化模板 DNA。对较长产物，小量提取的 DNA 可以在质粒线性化或酶切目的片段后直接标记。

不过，我们发现大的 DNA 分子常常不会是很好的模板，可能的原因是，如果聚合酶不在 DNA 模板分子的末端停止，酶就无效了。因此，将大 DNA 分子通过超声、加热或者酶切的方法处理后，再进行标记效果会更好（ 见 [ 4 ] 、[ 1 9 ] ) 。

检测转基因片段时，推荐使用生物素标记法 [ 图14.3  (a ) ] ，因为生物素是最小的半抗原，通常最易整合，市场上也有销售专用的生物素试剂盒。其次，许多不同的亲和素、链霉亲和素或者抗生物素抗体，能与荧光染料紧密而稳定的连接，这些都可以从市场上购得（ 如 Alexa  dyes和 Molecular   Probes公司）。作为第二对照或者指示探针，可用地高辛或直接荧光染料标记，建议使用 5S rDNA，因为它广泛存在，并且在许多物种中都有主荧光和次荧光位点 [ 图 14.3  ( a ) ] ，能提供最好的 FISH 实验对照。45S rDNA 也可以使用，但是常常有强荧光位点出现，其荧光信号强过转基因的杂交信号。另一个非常好用的是重复 DNA 序列，它可以帮助鉴定染色体。

3.4 玻片材料预处理

开始原位杂交前，应将玻片材料进行预处理以增强探针向目标位点的渗透，如用胃蛋白酶或蛋白水解酶处理表面蛋白，并减少非特异性探针与检测试剂的结合，如 RNA 酶和胃蛋白酶/蛋白水解酶处理。之后将样品用多聚甲醛和乙醇再固定，使样品经多次洗涤后仍稳定存在。

( 1 ) 所有步骤均于室温下染色缸里进行，除非其他说明。

( 2 ) 在每个玻片划标记处加入 200 μl RNA 酶，盖上塑料盖玻片，在保湿盒中温育 1 h。

( 3 ) 去掉盖玻片，将载玻片在 2x SSC 中洗涤两次，每次 5 min。

( 4 ) 玻片放入 10 mmol/L HCl 摇晃 2 min 左右，每张玻片迅速加入 200 μl 胃蛋白酶液，盖上塑料盖玻片，37℃ 温育 10 min  ( 见注6) 。

( 5 ) 在蒸馏水中洗脱盖玻片，然后用 2X SSC 洗玻片两次，每次 5 min。

( 6 ) 将玻片放入通风橱中盛有多聚甲醛固定剂的染色缸中放置 10 min。

( 7 ) 2X SSC 洗玻片两次，每次 5 min。

( 8 ) 浓度梯度乙醇逐级脱水（70% 、90% 和 96% 各 2 min ) , 风干。