六、重组质粒的转化

【实验目的】

学习和掌握感受态细胞的制备方法和转化实验的基本操作。

【实验原理】

将重组质粒转入大肠杆菌的过程称为转化。转化所用的大肠杆菌需要用物理或化学方法特殊处理，使重组DNA分子容易进入细胞内，被处理后易于接纳DNA分子的细胞称作感受态细胞。下面介绍感受态细胞的制备。

【实验试剂与器材】

大肠杆菌菌株，LB培养基，100mM CaCl2 ，DMSO或2-巯基乙醇，离心机，振荡器，冰浴

【实验方法与步骤】

（一）感受态细胞的制备

1.将大肠杆菌菌株在LB琼脂培养基上画线，37℃培养12～16h；

2.次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以200 rpm速度振荡培养12～16h；

3.取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以200 rpm的速度震荡培养直至A600值为0.5～0.6 (大约3h)；

4.将菌液置冰浴10min，然后2,500×g，4℃离心20min收集菌液；

5.弃上清，倒置离心管1min除净剩余液体，然后加入10ml冰冷的100mM CaCl2液悬浮细胞，冰浴10min；

6.4000rpm，4℃离心10min回收细胞，弃上清，每50ml原培养物再加入2ml冰冷100mM CaCl2溶液悬浮细胞；

7.按每份200?滋l分装，4℃可保存1~2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15%，置-70℃备用。

【注意事项】

大肠杆菌必须从LB培养基琼脂平板上获得单菌落，37℃过夜培养12～16h，第二天按1～5%接种，直至A600值为0.5～0.6；

（二）重组质粒的转化

1.将感受态细胞置冰上融化，然后加入 DMSO或2-巯基乙醇，混合后加入L连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30min；

2.42℃水浴45秒，然后迅速放回冰中1～2min；

3.加入2ml LB培养液，37℃轻摇荡培养1h；

4.4,000×g离心10秒钟，弃上清，用LB培养液重悬菌体；

5.将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20～30min，倒置于37℃孵箱中培养12～16h。

（三）转化细胞的筛选

【实验原理】

1、 蓝白筛选:

以TA克隆载体pRCII转入大肠杆菌为例。TA克隆载体pRCII含有LacZ 基因，多克隆酶切位点位于其间，当没有外源基因插入LacZ基因中时，LacZ基因的启动子可使此基因编码半乳糖苷酶，从而催化底物X-gal发生化学反应，菌落变成蓝色；当外源基因与pRCII载体发生连接时，LacZ基因失活，菌落呈白色；同时该质粒还含有氨苄青霉素耐药基因。根据此特性，白色菌落含有重组质粒。在用这种质粒进行克隆时，转化平板培养基中要加入0.5mM IPTG、50g/ml氨苄青霉素及140g/ml X-gal。

作为载体的质粒都含有一种或两种抗生素的耐药基因，当把这种质粒转入大肠杆菌后，此菌便获得了抵抗这种抗生素的能力。目前分子克隆所用的克隆载体多含氨苄青霉素耐药基因，所以涉及最多的是氨苄青霉素筛选。当将氨苄青霉素加入培养基中后，只有含质粒的细菌能够繁殖，而不含质粒的细菌则不能繁殖形成菌落。此种筛选不能鉴别重组质粒或自身环化的质粒。在用含氨苄青霉素耐药基因的质粒进行克隆时，转化平板培养基中要加入氨苄青霉素。

（四）质粒和菌株的保存:

1.质粒可以在-20℃冰冻保存。

2.菌株可在含8～15%甘油培养液中-20℃或-70℃保存。也可在半固体LB琼脂培养基中穿刺保存