超声波萃取—压液和谱法的提取、验证方法
提取方法
将堆肥样品(0.5g)放入离心管中，加入已知浓度的标准雌激素混合物;然后用高速涡旋匀浆(1min)，在4℃下保持12 h，以保证药物的吸附。同时制备了非加标堆肥的对照样品。
将体积为5ml的甲醇加入到加标的堆肥样品中;然后，涡旋1分钟，超声15分钟，在4000转/分、4℃下离心5分钟。然后倒出上料，用温和的氮气流蒸发至40C干燥，用1ml甲醇(10%)重组。接下来，固相萃取(SPE)，用 HLB 60 mg-6 ml Supelco进行净化。首先，用3ml甲醇和5ml超纯水对墨盒进行调节，然后，对提取液(1ml)进行过滤，丢弃滤液。墨盒在真空条件下(<2 kPa)干燥1分钟，然后用6mL甲醇(10%)洗涤。在真空条件下(>2 kPa)再次干燥1分钟，用6ml甲醇(10%)洗脱。接下来，用温和的氮气流浓缩洗液，直到在40℃下干燥，用500uL乙腈(ACN)重组。然后用0.2 um PTFE Whatman过滤器过滤，将提取液转移到1mL小瓶中进行 UHPLC-MS/MS分析。
提取效率，即平均回收率，是通过对10个堆肥样品的萃取物进行分析确定的，这些堆肥样品加入了已知雌激素浓度的标准混合物，低(6.0ng-g)、中(60.0 ng-g)和高(堆肥:180ng-g)。平均回收率的变异系数必须小于15%。
超高压液相色谱和质谱法
用UHPLC-MS/MS对重组提取物中的雌激素进行分离和分析。Acquity超高压液相色谱系统(Waters)由脱气器、二元梯度泵、自动进样器(5℃)和柱式烘箱(40℃)组成。所有化合物均使用UHPLC KinetexTM2.6 um XB-C18100 a LC (50 x4.6 mm)柱在单一梯度运行中分离。色谱条件为流速1mL-min，进样量10μL。采用 AB SCIEX API-5000TM三重四极杆(Applied Biosystems/MDS SCIEX)，在负模式下电喷雾电离(ESI)，通过多重反应监测(MRM)检测分析物。流动相为水:ACN(50:50)等压相。MS参数分别为cad气体和幕压8 psig和10 psig,GS1/雾化器和GS2/涡轮气体流速分别设置为20L-min。离子喷雾电压(IS)固定构-4500V，源温度固定为400℃。
方法验证
验证是根据国际分析方法验证统一会议的指导方针进行的。这些准则通常用于制药业的产品纯度测试，而不是用于环境监测;然而，一些测试在验证上是相似的。本研究按照以下标准对方法进行验证:线性度、检出限(LOD)和定量限(LOQ)、日内精密度(重复性)和日内精密度(再现性)。线性通过决定系数(R2>0.98)和响应因子间变异系数(CV<15%)验证各分析物的校准曲线线性。为了生成校准曲线，制备了标准的雌激素混合物，得到五种不同浓度的溶液(10 ng-mL-'，50 ng-mL,100 ngmL-，500 ngmL和1000 ngmL)。加入0.5g(干基)堆肥样品。
结论
建立了超声溶剂萃取-固相萃取-超高效液相色谱-质谱联用分析的同时提取、检测和定量生物感染性危险废弃物堆肥中4种雌激素的方法。该方法符合国际分析验证统一会议的的验证标准。获得了适宜的线性水平。适当的样品制备、以甲醇为提取溶剂的超声波提取、用HLB 60mg-6ml Supelco和乙腈重构洗脱液进行充分的清理是保证四种雌激素高回收率的必要条件。使用水和ACN(50:50)的等温流动相，在负模式下电喷雾电离，仅在1.5分钟内实现了适当的化七合物分离。LC0Q在文献中报道的类似基质(如土壤、改良土壤、污泥、消化污泥、沉积物和堆肥生物固体)的值范围内。因此，该亥分析方法被推荐用于测定与使用的具有负电离和类似结构的雌激素。它的应用将有助于有合适的化合物回收率，可接受的检测和定量水平。
