绘制细胞增殖曲线
实验概要
为了掌握细胞的增殖速率,常用的方法有不同时间点细胞数目统计、MTT法绘制增殖曲线等。下面以MTT法为例,简述绘制增殖曲线的方法。
实验原理
活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的MTT为蓝紫色的不溶于水的甲瓉(formazan),甲瓉的多少可通过酶标仪测定其在490nm处的光密度(Optical
Density,OD)值而得知。因为甲瓉生成量在通常情况下与活细胞数成正比,因此可以通过OD值推测活细胞数目,了解药物抑制或杀伤细胞的能力。
主要试剂
DPBS、5mg/mLMTT
待检测的药物根据实验要求设置浓度梯度
主要设备
96孔平底板、酶联免疫监测仪
实验步骤
(1)收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,在96孔平底板每孔加入100μL细胞悬液,铺板使待测细胞调密度至每孔约1000~10000个细胞,边缘孔用无菌DPBS填充。
(2)5%CO2、37℃培养箱孵育约12 h,至细胞单层铺满孔底,加入浓度梯度的药物。
(3)5%CO2、37℃孵育16~48 h,于倒置显微镜下观察细胞密度和细胞形态。
(4)每孔加入20μL5mg/mL MTT溶液,继续培养4~8h。
注意:若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用DPBS冲2~3遍后,再加入含MTT的培养液。
(5)终止培养,小心吸去孔内培养液。
(6)每孔加入150μL DMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。通过酶联免疫检测仪,测量490nm处的吸光值。
(7)用不同的生长时间和吸光值作图,横轴为时间点,纵轴为吸光值。
注意:
MTT法只能测定细胞的相对数和相对活力,不能测定细胞的绝对数。
用MTT检测时,尽量无菌操作,细菌会对MTT结果产生影响。
MTT实验结果波动较大,应多设置重复孔,并且做好预实验,优化实验条件,尽可能减小实验结果差异。
接种细胞的细胞数和细胞悬液的均匀程度对MTT结果有很大影响。尽量使细胞处于对数期的时候进行检测,并且,初始接种的细胞悬液一定要均匀。